Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido
Summary
Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.
Abstract
As células-tronco embrionárias humanas demonstram uma capacidade única de responder a morfogênios in vitro por padrões de autoorganização da especificação de destino celular que correspondem à formação de camada germinativa primária durante a embriogênese. Assim, essas células representam uma ferramenta poderosa com a qual examinar os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento humano precoce. Desenvolvemos um método para cultura de células-tronco embrionárias humanas em colônias confinadas em substratos complacentes que fornecem controle sobre a geometria das colônias e seu ambiente mecânico, a fim de recapitular os parâmetros físicos que embriogênese fundamentam. A característica chave deste método é a habilidade de gerar hidrogéis do poliacrilamida com testes padrões definidos do ligante extracelular da matriz na superfície para promover o acessório da pilha. Isto é conseguido fabricando stencils com os padrões geométricos desejados, usando esses estênceis para criar padrões de ligante de matriz extracelular em coberturas de vidro, e Transferindo esses padrões para hidrogéis de poliacrilamida durante a polimerização. Este método também é compatível com a microscopia de força de tração, permitindo ao usuário medir e mapear a distribuição de forças geradas por células dentro das colônias confinadas. Em combinação com ensaios bioquímicos padrão, essas medições podem ser usadas para examinar o papel que as pistas mecânicas desempenham na especificação do destino e na morfogênese durante o desenvolvimento humano precoce.
Introduction
Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) possuem grande promessa para uso em aplicações de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos. A natureza pluripotente destas células dá-lhes a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula adulta. Enquanto grandes avanços foram feitos na direção do destino de hESCs a tipos de células particulares, manteve-se muito difícil de gerar tecidos inteiros ou órgãos de novo1,2,3,4, a 5. Isto é devido, em grande parte, a uma compreensão limitada dos mecanismos que impulsionam a formação destes tecidos durante o desenvolvimento humano. A fim de preencher essa lacuna no conhecimento, vários métodos surgiram nos últimos anos para modelar o embrião precoce e estágios subsequentes de desenvolvimento com células-tronco embrionárias6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Logo após a derivação das primeiras linhagens de hESC14, foi demonstrado que corpos embrióides formados a partir de hESCs eram capazes de produzir espontaneamente células das três camadas germinativas primárias6. No entanto, devido à inerente falta de controle sobre o tamanho e a morfologia dos corpos embrióides, a organização das camadas germinativas variou significativamente e não combinou com a organização do embrião precoce. Mais recentemente, Warmflash et al. desenvolveram um método para confinar colônias de hESCs em substratos de vidro via micropadronização, proporcionando controle e consistência sobre o tamanho e a geometria das colônias8. Na presença de BMP4, um What importante no desenvolvimento adiantado, estas colônias confinadas eram capazes de testes padrões reprodutíveis Self-organizando da especificação aos destinos que representam as camadas de germe preliminares. Embora isso tenha proporcionado um modelo útil para estudar os mecanismos pelos quais se estabelecem as camadas germinativas primárias, os padrões de especificação do destino não correspondem precisamente à organização e à morfogênese observadas durante a embriogênese15. Uma recapitulação mais fiel do desenvolvimento embrionário precoce foi conseguida através da incorporação de hESCs em uma matriz extracelular tridimensional (ECM) do matrigel11, proporcionando a evidência mais forte até à data para a capacidade de hESCs se AutoOrganizar e modelar estágios iniciais da embriogênese ex vivo. No entanto, esse método produz resultados inconsistentes e, portanto, é incompatível com um número de ensaios que poderiam ser usados para revelar os mecanismos subjacentes de autoorganização e especificação de destino.
Diante desses métodos existentes e suas respectivas limitações, buscou-se desenvolver um método de cultivo reacional de colônias de hESC de geometrias definidas em condições que modelem o ambiente extracelular do embrião precoce. Para isso, utilizamos hidrogéis de poliacrilamida de elasticidade ajustável para controlar as propriedades mecânicas do substrato. Usando microscopia de força atômica em embriões de frango em estágio de gastrulação, descobrimos que a elasticidade do epiblasto variou de centenas de pascals a alguns kilopascals. Assim, concentramos-nos na geração de hidrogéis de poliacrilamida com elasticidade nesta faixa para servir como substrato para colônias de hESC. Nós modificamos nossos métodos anteriores para a cultura de hESCs em hidrogéis de poliacrilamida7,9 para fornecer um controle robusto sobre a geometria das colônias. Nós conseguimos este pela primeira padronização ligands ECM, ou seja, matrigel, em coberturas de vidro através de stencils microfabricados, como relatado anteriormente16. Nós projetamos então uma técnica nova para transferir o ligante modelado à superfície de hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização. O método que descrevemos aqui envolve o uso de fotolitografia para fabricar uma bolacha de silício com os padrões geométricos desejados, criando selos de teses características geométricas com polidimetilsiloxano (PDMS), e usando esses selos para gerar os estênceis que em última análise, permitir a padronização de ligante na superfície de coberturas de vidro e transferência para poliacrilamida.
Além de recapitular o ambiente mecânico do embrião precoce, confinando colônias de hESC em poliacrilamida possibilita a mensuração de forças geradas por células com microscopia de força de tração (TFM), conforme relatado em nosso método anterior9. Em resumo, os grânulos fluorescentes podem ser encaixados no poliacrilamida e ser usados como marcadores de a. As forças geradas por células são calculadas por imagem do deslocamento dessas esferas após a semeadura de hESCs no substrato padronizado. Além disso, os mapas de força de tração resultantes podem ser combinados com ensaios tradicionais, como imunocoloração, para examinar como a distribuição de forças geradas por células em colônias de hESC confinadas pode regular ou modular a sinalização a jusante. Nós esperamos que estes métodos revelarão que as forças mecânicas jogam um papel crítico no padronização da especificação do Fate da pilha durante o desenvolvimento embrionário adiantado que é negligenciado atualmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para simplificar um protocolo longo e detalhado, este método consiste em três estágios críticos: 1) gerando testes padrões do ligante do ECM em COVERSLIP de vidro, 2) transferindo os testes padrões aos hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização do gel, e 3) semeando hESCs no hidrogel modelado. Há etapas críticas que devem ser consideradas em cada uma dessas três etapas. A fim de gerar padrões de alta fidelidade nas coberturas de vidro, o estêncil deve ser firmemente pressionado na lamínula para ev…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer o financiamento do CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. gostaria de agradecer a FuiBoon Kai, Dhruv Thakar, e Roger Oria para várias discussões que orientaram a geração e solução de problemas deste método. J.M.M. também agradece a UCSF Discovery Fellowship para o apoio contínuo de seu trabalho.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Referencias
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