Узор геометрия человеческих эмбриональных колоний стволовых клеток на совместимых субстратов для управления тканью уровня механики
Summary
Внеклеточные матричные лиганды могут быть узорчатына на гидрогели полиакриламид, чтобы культура эмбриональных стволовых клеток человека в ограниченных колониях на совместимых субстратах. Этот метод может быть объединен с микроскопией силы тяги и биохимическими анализами для изучения взаимодействия между геометрией тканей, силами, генерируемыми клетками, и спецификацией судьбы.
Abstract
Эмбриональные стволовые клетки человека демонстрируют уникальную способность реагировать на морфогены в пробирке самоорганизующиеся модели спецификации судьбы клеток, которые соответствуют первичному образованию зародышевого слоя во время эмбриогенеза. Таким образом, эти клетки представляют собой мощный инструмент для изучения механизмов, которые управляют ранним развитием человека. Мы разработали метод культуры эмбриональных стволовых клеток человека в замкнутых колониях на совместимых субстратах, который обеспечивает контроль как над геометрией колоний, так и над их механической средой, чтобы резюмировать физические параметры, которые в основе эмбриогенеза. Ключевой особенностью этого метода является способность генерировать гидрогели полиакриламид с определенными паттернами внеклеточного матричного лиганда на поверхности для содействия вложению клеток. Это достигается путем изготовления трафаретов с желаемыми геометрическими узорами, использования этих трафаретов для создания узоров внеклеточного матричного лиганда на стеклянных крышках, и переноса этих узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации. Этот метод также совместим с микроскопией силы тяги, что позволяет пользователю измерять и картировать распределение клеточных сил в пределах ограниченных колоний. В сочетании со стандартными биохимическими анализами, эти измерения могут быть использованы для изучения роли механических сигналов в спецификации судьбы и морфогенеза в начале человеческого развития.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) имеют большие перспективы для использования в регенеративной медицине и применениях тканей. Плюрипотентная природа этих клеток дает им возможность дифференцироваться в любой тип клеток взрослого. Хотя большие успехи были сделаны в направлении судьба hESCs к конкретным типам клеток, она остается очень трудно генерировать целые ткани или органы de novo1,2,3,4, 5. Это в значительной степени объясняется ограниченным пониманием механизмов, которые приводят к образованию этих тканей в процессе развития человека. Для того, чтобы восполнить этот пробел в знаниях, в последние годы появился ряд методов моделирования раннего эмбриона и последующих стадий развития с эмбриональными стволовыми клетками6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Вскоре после получения первых линий hESC14, было продемонстрировано, что эмбриональные тела, образованные из hESCs были способны спонтанно производить клетки из трех основных слоев зародыша6. Однако из-за присущего ему отсутствия контроля над размером и морфологией эмбриональных тел организация зародышевых слоев значительно изменилась и не соответствовала организации раннего эмбриона. Совсем недавно, Warmflash и др. разработали метод, чтобы ограничить колонии hESCs на стеклянных субстратов через микропаттернинг, обеспечивая контроль и согласованность над размером и геометрией колоний8. В присутствии BMP4, важного морфогена в раннем развитии, эти замкнутые колонии были способны самоорганизовать воспроизводимые модели спецификации к судьбам, представляющим первичные слои микробов. Хотя это дало полезную модель для изучения механизмов, с помощью которых устанавливаются первичные слои микробов, модели спецификации судьбы точно не соответствовали организации и морфогенезу, наблюдаемым во время эмбриогенеза15. Более верный повторение раннего эмбрионального развития было достигнуто путем встраивания hESCs в трехмерную внеклеточную матрицу (ECM) матригель11, обеспечивая на сегодняшний день убедительные доказательства способности ГССК самоорганизоваться и моделировать ранних стадиях эмбриогенеза ex vivo. Однако этот метод дает противоречивые результаты и, таким образом, несовместим с рядом анализов, которые могут быть использованы для выявления основополагающих механизмов самоорганизации и спецификации судьбы.
Учитывая эти существующие методы и их соответствующие ограничения, мы стремились разработать метод воспроизводства колоний hESC определенных геометрий в условиях, которые моделируют внеклеточной среды раннего эмбриона. Для этого мы использовали гидрогели полиакриламидового упругости для управления механическими свойствами субстрата. Используя атомную силовую микроскопию на куриных эмбрионах на стадии гастрирования, мы обнаружили, что эластичность эпибласта варьировалась от сотен паскалей до нескольких килопаскалей. Таким образом, мы сосредоточились на генерации гидрогелей полиакриламидов с эластичностью в этом диапазоне, чтобы служить в качестве субстрата для колоний HESC. Мы модифицировали наши предыдущие методы культивирования ГЭС на полиакриламидных гидрогелях7,9, чтобы обеспечить надежный контроль над геометрией колоний. Мы достигли этого путем первого узора ECM лиганды, а именно matrigel, на стеклянные крышки через микрофабрикаты трафаретов, как ранее сообщалось16. Затем мы разработали новую технику для переноса узорчатого лиганда на поверхность гидрогелей полиакриламидов во время полимеризации. Метод, который мы описываем здесь включает в себя использование фотолитографии для изготовления кремниевой пластины с желаемыми геометрическими узорами, создание марок диссертаций геометрических особенностей с полидиметилсилоксаном (PDMS), и с помощью этих марок для создания трафаретов, которые в конечном счете позволяют узор лиганда на поверхность стеклянных покрывающих и переносить на полиакриламид.
В дополнение к повторению механической среды раннего эмбриона, ограничение hESC колоний на полиакриламид позволяет измерения клеточных сил с помощью маслечной микроскопии силы (TFM), как сообщалось в нашем предыдущем методе9. Короче говоря, флуоресцентные бусы могут быть встроены в полиакриламид и использоваться в качестве фидуциальных маркеров. Силы, генерируемые клетками, рассчитываются путем визуализации смещения этих бусин после посева hESCs на узорчатый субстрат. Кроме того, полученные карты силы тяги могут быть объединены с традиционными анализами, такими как иммуностогирование, для изучения того, как распределение клеточных сил в замкнутых колониях HESC может регулировать или модулировать вниз по течению сигнализации. Мы ожидаем, что эти методы покажут, что механические силы играют важную роль в моделиции спецификации судьбы клеток во время раннего эмбрионального развития, которое в настоящее время упускается из виду.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для упрощения длинного и детального протокола этот метод состоит из трех критических стадий: 1) генерации моделей ECM ligand на стеклянных крышках, 2) переноса узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации геля и 3) посевных ГЭС на узорчатый гидрогель. Есть критические шаги, кото…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить финансирование из гранта CIRM RB5-07409. JMM хотел бы поблагодарить FuiBoon Кай, Dhruv Thakar, и Роджер Ория для различных дискуссий, которые руководствовались генерации и устранения неполадок этого метода. JMM также благодарит UCSF Discovery Стипендию за постоянную поддержку его работы.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Referencias
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
