Patrón de la geometría de las colonias de células madre embrionarias humanas en sustratos compatibles para controlar la mecánica de nivel de tejido
Summary
Los ligandos de matriz extracelular se pueden patrones en hidrogeles de poliacrilamida para permitir el cultivo de células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles. Este método se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos bioquímicos para examinar la interacción entre la geometría del tejido, las fuerzas generadas por células y la especificación del destino.
Abstract
Las células madre embrionarias humanas demuestran una capacidad única para responder a los morfogens in vitro mediante patrones autoorganizadores de especificación del destino celular que corresponden a la formación primaria de la capa germinal durante la embriogénesis. Por lo tanto, estas células representan una poderosa herramienta con la que examinar los mecanismos que impulsan el desarrollo humano temprano. Hemos desarrollado un método para cultivar células madre embrionarias humanas en colonias confinadas en sustratos compatibles que proporciona control sobre la geometría de las colonias y su entorno mecánico con el fin de recapitular los parámetros físicos que embriogénesis de la subestimación. La característica clave de este método es la capacidad de generar hidrogeles de poliacrilamida con patrones definidos de ligando de matriz extracelular en la superficie para promover la unión celular. Esto se logra fabricando plantillas con los patrones geométricos deseados, utilizando estas plantillas para crear patrones de ligando de matriz extracelular en los labios de las cubiertas de vidrio, y transfiriendo estos patrones a hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización. Este método también es compatible con la microscopía de fuerza de tracción, lo que permite al usuario medir y mapear la distribución de las fuerzas generadas por células dentro de las colonias confinadas. En combinación con los ensayos bioquímicos estándar, estas mediciones se pueden utilizar para examinar el papel que desempeñan las señales mecánicas en la especificación del destino y la morfogénesis durante el desarrollo humano temprano.
Introduction
Las células madre embrionarias humanas (HESC) son muy prometedoras para su uso en aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. La naturaleza pluripotente de estas células les da la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula adulta. Si bien se han hecho grandes avances en la dirección del destino de los hESC a determinados tipos de células, se ha mantenido muy difícil generar tejidos enteros u órganos de novo1,2,3,4, 5. Esto se debe, en gran parte, a una comprensión limitada de los mecanismos que impulsan la formación de estos tejidos durante el desarrollo humano. Con el fin de colmar este vacío de conocimiento, en los últimos años han surgido una serie de métodos para modelar el embrión temprano y las etapas posteriores de desarrollo con células madre embrionarias6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Poco después de la derivación de las primeras líneas14del hESC, se demostró que los cuerpos embrionarios formados a partir de hESC eran capaces de producir espontáneamente células de las tres capas germinales primarias6. Sin embargo, debido a la falta inherente de control sobre el tamaño y la morfología de los cuerpos embrionarios, la organización de las capas germinales varió significativamente y no pudo igualar la organización del embrión temprano. Más recientemente, Warmflash y otros desarrollaron un método para confinar colonias de hESC en sustratos de vidrio a través de micropatrones, proporcionando control y consistencia sobre el tamaño y la geometría de las colonias8. En presencia de BMP4, un importante morógeno en desarrollo temprano, estas colonias confinadas eran capaces de autoorganizar patrones reproducibles de especificación a los destinos que representaban las capas de gérmenes primarios. Aunque esto proporcionó un modelo útil para estudiar los mecanismos por los cuales se establecen las capas primarias de gérmenes, los patrones de especificación del destino no coincidieron exactamente con la organización y la morfogénesis observada durante la embriogénesis15. Se logró una recapitulación más fiel del desarrollo embrionario temprano mediante la incorporación de hESC en una matriz extracelular tridimensional (ECM) de matrigel11,proporcionando la evidencia más sólida hasta la fecha de la capacidad de los hESC para autoorganizarse y modelar las primeras etapas de la embriogénesis ex vivo. Sin embargo, este método produce resultados inconsistentes y, por lo tanto, es incompatible con una serie de ensayos que podrían utilizarse para revelar los mecanismos subyacentes de la autoorganización y la especificación del destino.
Dados estos métodos existentes y sus respectivas limitaciones, buscamos desarrollar un método para cultivar reproduciblemente colonias hESC de geometrías definidas en condiciones que modelen el entorno extracelular del embrión temprano. Para lograrlo, utilizamos hidrogeles de poliacrilamida de elasticidad ajustable para controlar las propiedades mecánicas del sustrato. Usando la microscopía de fuerza atómica en embriones de pollo en etapa de gastralación, encontramos que la elasticidad del epiblasto oscilaba entre cientos de pascales y unos pocos kilopascales. Así, nos centramos en la generación de hidrogeles de poliacrilamida con elasticidad en esta gama para servir como sustrato para las colonias de hESC. Modificamos nuestros métodos anteriores para el cultivo de hESC en hidrogeles de poliacrilamida7,9 para proporcionar un control robusto sobre la geometría de las colonias. Lo logramos modelando primero los ligandos ECM, a saber, matrigel, en los cubredes de vidrio a través de plantillas microfabricadas, como se informó anteriormente16. A continuación diseñamos una técnica novedosa para transferir el ligando estampado a la superficie de los hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización. El método que describimos aquí implica el uso de fotolitografía para fabricar una oblea de silicio con los patrones geométricos deseados, la creación de sellos de estas características geométricas con polidimetilsiloxano (PDMS), y el uso de estos sellos para generar las plantillas que en última instancia, permitir el patrón de ligando sobre la superficie de los revestimientos de vidrio y transferir a poliacrilamida.
Además de recapitular el entorno mecánico del embrión temprano, el confinamiento de colonias hESC en poliacrilamida permite la medición de fuerzas generadas por células con microscopía de fuerza de tracción (TFM), como se informó en nuestro método anterior9. En resumen, las cuentas fluorescentes se pueden incrustar en la poliacrilamida y utilizarse como marcadores fiduciarios. Las fuerzas generadas por células se calculan por imágenes del desplazamiento de estas cuentas después de sembrar los heSC en el sustrato estampado. Además, los mapas de fuerza de tracción resultantes pueden combinarse con ensayos tradicionales, como la inmunomancha, para examinar cómo la distribución de las fuerzas generadas por células en colonias de hESC confinadas puede regular o modular la señalización aguas abajo. Esperamos que estos métodos revelen que las fuerzas mecánicas desempeñan un papel crítico en el patrón de la especificación del destino celular durante el desarrollo embrionario temprano que actualmente se pasa por alto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para simplificar un protocolo largo y detallado, este método consta de tres etapas críticas: 1) generar patrones de ligando ECM en cubiertas de vidrio, 2) transferir los patrones a hidrogeles de poliacrilamida durante la polimerización del gel, y 3) sembrar hESC en el hidrogel estampado. Hay pasos críticos que deben ser considerados en cada una de estas tres etapas. Con el fin de generar patrones de alta fidelidad en las cubiertas de vidrio, la plantilla debe ser firmemente presionada sobre la cubierta para evitar la…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer la financiación de la subvención DE CIRM RB5-07409. J.M.M. desea agradecer a FuiBoon Kai, Dhruv Thakar y Roger Oria por varias discusiones que guiaron la generación y solución de problemas de este método. J.M.M. también agradece a la UCSF Discovery Fellowship por el apoyo continuo de su trabajo.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Referencias
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
