荧光激活细胞分拣，用于分离瘦杆菌细胞群

Summary

珊瑚创造了对人类和海洋生物都重要的生物多样性生态系统。然而，我们仍然不明白许多珊瑚细胞的全部潜力和功能。在这里，我们提出了为石珊瑚细胞群的分离、标记和分离而开发的协议。

Abstract

由于人为压力因素，珊瑚礁受到威胁。珊瑚对这些压力器的生物反应可能发生在细胞水平上，但这些机制并不十分了解。为了研究珊瑚对压力器的反应，我们需要分析细胞反应的工具。特别是，我们需要有助于应用功能检测的工具，以更好地了解细胞群对压力的反应。在目前的研究中，我们使用荧光激活细胞分拣（FACS）来分离和分离石珊瑚中不同的细胞群。该协议包括：（1） 珊瑚组织与骨骼分离，（2） 创建单个细胞悬浮液，（3） 使用各种标记标记标记珊瑚细胞进行流细胞测定，以及 （4） 门控和细胞分拣策略。这种方法将使研究人员能够在细胞水平上研究珊瑚，以便对不同的细胞群进行分析、功能测定和基因表达研究。

Introduction

珊瑚礁是地球上最重要的生态系统之一。它们通过提供鱼类和无脊椎动物的关键栖息地促进生物多样性，并通过旅游业¹提供粮食和经济生计，对维持人类社区至关重要。作为珊瑚礁的主要建设者，珊瑚动物（Phylum：Cnidaria）也通过创建大型碳酸钙框架来缓解海浪和风暴破坏^2，帮助沿海社区。

珊瑚作为成人是分离动物，容纳广泛的内生生物伙伴，包括病毒，古生物，细菌，蛋白物，真菌，最值得注意的是，藻类二丁那胶酸盐家族共生^体3的成员。环境的变化可能导致这个社区的不平衡，往往导致疾病爆发和珊瑚白化，其中共生共生共生体被逐出珊瑚群落，从而消除珊瑚的主要营养来源。这两种情况经常导致珊瑚宿主^{44、5、65,6}的死亡。人为诱发的压力因素的影响，如快速的气候变化，正在加速大规模珊瑚死亡事件，导致全球珊瑚礁减少^7。

最近，已经开发了许多不同的方法来帮助减轻珊瑚礁的损失。这些方法包括在现有珊瑚礁上种植珊瑚，使用耐热基因型进行基因交叉，以及对珊瑚^88、99内托管的微生物和共生群落进行细胞操作。尽管作出了这些努力，关于珊瑚细胞多样性和细胞功能^{10、11、12、13,12,13}仍不为人所知。^10,要了解珊瑚生物在规范和紧张条件下行为的方式，必须全面了解珊瑚细胞类型的多样性和细胞功能。对细胞多样性和基因功能如何耦合的理解将得益于最大限度地提高恢复和保存效率的努力。

以前关于细胞多样性和功能的研究主要集中在组织学研究和全组织RNA取样14，15，16，17。^14,15,16,17为了更详细地了解珊瑚中的特定细胞类型功能，需要有分离活珊瑚细胞特定种群的方法。这已经成功地在非经典模型生物体中，通过荧光活性细胞分选（FACS）流动细胞测量技术^18。FACS 利用调谐到不同波长的激光组合来测量单个细胞级别的不同内源细胞特性，如相对细胞大小、细胞粒度和自荧光。此外，细胞可能用荧光标记的化合物标记，以测量特定的，所需的属性^{18，19。18,}

到目前为止，流细胞学在珊瑚细胞中的应用主要是利用其强、天然自氟化^{20、21、22,22}的共生共生共生生物和其他细菌种群进行分析。^20,FACS也被用来估计珊瑚基因组的大小，通过使用荧光DNA标记信号比较参考模型有机体细胞^{23，24。23,}FACS的有效应用提供了三种不同的工具，对细胞生物学研究有用：1） 单细胞的形态和功能描述;2） 识别、分离和分离下游研究的特定细胞群;和3）单细胞水平功能测定分析。

各种外源荧光标记物的开发和应用，用于研究珊瑚细胞，目前仍有待开发。此类标记可能包括标记的蛋白质、酶标记的基质或对其他化合物的荧光反应。这些标记可用于识别具有唯一属性的细胞类型，例如突出显示产生不同量特定细胞室特征（如隔离体）的单元格。另一个例子是使用荧光标记的珠子来功能识别能够进行噬菌体细胞的细胞，或吞没靶向病原体^25。在免疫反应中活跃的细胞群，在吞没这些外源应用的珠子后，可以很容易地识别出。虽然传统的组织学方法需要保存的组织和几个小时来近似珠类吞没的阳性细胞的百分比，但基于FACS的病原体吞没功能测定可以在分离的活细胞上相对快速地进行。除了研究细胞对压力的特异性反应外，该技术还有可能阐明基因特异性表达，并阐明细胞类型的进化和发育历史，这些细胞类型完全为细胞类型所独有，这些细胞类型完全为细胞类型所独有，如卡利波和神经细胞。

最近，我们对30多个细胞标记进行了密集筛选，从而确定了24个能够标记珊瑚细胞的标记，其中16个可用于区分独特的种群^18，使它们成为分化集群（CD）。在这里，我们描述了在波西洛波拉达米科尼斯的珊瑚细胞分离过程，从从碳酸钙骨架中取出细胞到用FACS识别和隔离特定细胞群（图1）。

Protocol

1. 通过喷枪和压缩机从珊瑚骨架分离组织 注：在冰上执行步骤，用手套保护双手。 通过连接空气压缩机、软管和喷枪来组装喷枪套件（图2）。将压力表设置为 276×483 kPa 之间。注： 本研究所用的推荐压缩机和空气软管预设为最大压力为 393 kPa。在此 276-483 kPa 范围之外使用可能会导致细胞从骨架中去除不足或细胞膜破裂。此范围可能因每个物?…

Representative Results

总体而言，该协议非常有用，因为它有助于识别和收集可用于功能分析的活珊瑚细胞种群。工作流程开始于珊瑚组织与底层碳酸钙骨架的机械分离（图1）。这是最重要的初始步骤之一，因为不当技术会导致高细胞死亡率，并会产生大量碎片。不建议进行酶分离，因为它可能导致组织剪切增加和细胞死亡率高。使用喷枪进行机械分离可减少这些挑战（…

Discussion

该协议改编自罗森塔尔等人¹⁸号，用于识别和隔离P.Damicornis细胞。该方法侧重于通过检查细胞内在因素（包括相对细胞大小、相对细胞粒度、细胞自荧）和完整细胞膜的存在，过滤样品以去除碎屑、非活细胞和共生细胞承载细胞的过程。这些技术可以应用于其他珊瑚物种。然而，FACS浇注策略可能因细胞种群特征的物种特异性差异而异。

FACS对了解珊瑚?…

Materials

Airbrush Kit & Compressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria II	BD	644832
Bone Cutters	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm
Collection bag	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemacytometer
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294	1.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
Round-bottom tubes	VWR	352063	5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube
Syringe	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate