Tri cellulaire activée par fluorescence pour l’isolement des populations de cellules sclérosiennes

Summary

Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.

Abstract

Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.

Introduction

Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme¹. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes².

Les coraux à l’âge adulte sont des animaux sessiles qui accueillent un large éventail de partenaires endosymbiotiques, y compris les virus, l’archaea, les bactéries, les protistes, les champignons, et plus particulièrement, les membres de la famille algale dinoflage Symbiodiniaceae³. Les changements dans l’environnement peuvent causer des déséquilibres dans cette communauté, entraînant souvent des épidémies et le blanchiment des coraux dans lesquels les Symbiodiniaceae symbiotiques sont expulsés de la colonie de corail, éliminant ainsi la principale source de nutrition pour le corail. Ces deux scénarios causent souvent la mort de l’hôte corallien^4,5,6. Les effets des facteurs de stress induits par l’anththénie, tels que le changement climatique rapide, accélèrent les décès massifs de coraux, ce qui entraîne un déclin mondial des récifs coralliens⁷.

Récemment, de nombreuses méthodes différentes ont été développées pour aider à atténuer la perte de récifs coralliens. Ces méthodes comprennent l’aménagement de coraux sur les récifs existants, la traversée génétique à l’aide de génotypes tolérants thermiquement, et la manipulation cellulaire des communautés microbiennes et symbiotiques hébergées dans le corail^8,9. Malgré ces efforts, beaucoup reste inconnu sur la diversité des cellules coralliennes et la fonction cellulaire^10,11,12,13. Une compréhension approfondie de la diversité de type de cellules coralliennes et de la fonction cellulaire est nécessaire pour comprendre comment l’organisme corallien se comporte dans des conditions normatives et stressantes. Les efforts visant à maximiser l’efficacité de la restauration et de la préservation bénéficieront d’une meilleure compréhension de la façon dont la diversité cellulaire et le fonctionnement des gènes sont couplés.

Les travaux antérieurs sur la diversité et la fonction cellulaires ont principalement porté sur les études histologiques et l’échantillonnage de l’ARN de tissu entier^14,15,16,17. Pour obtenir plus de détails sur la fonction spécifique de type cellulaire dans les coraux, il doit y avoir des méthodes pour l’isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes vivantes. Ceci a été fait avec succès dans les organismes modèles non classiques au moyen de la technologie de cytométrie de débit activée par fluorescence (FACS)¹⁸. FACS utilise une combinaison de lasers réglés à différentes longueurs d’onde pour mesurer différentes propriétés cellulaires endogènes au niveau de la cellule unique comme la taille relative des cellules, la granularité cellulaire et l’autofluorescence. En outre, les cellules peuvent être marquées par des composés étiquetés fluorescents pour mesurer les propriétés spécifiques et souhaitées^18,19.

Jusqu’à présent, l’application de la cytométrie des débits aux cellules coralliennes a été principalement pour l’analyse de Symbiodiniaceae symbiotique et d’autres populations bactériennes en utilisant leur forte, autofluorescence naturelle^20,21,22. FACS a également été utilisé pour estimer la taille du génome corallien en utilisant le signal fluorescent marqueur d’ADN par rapport aux cellules d’organisme modèle de référence^23,24. L’application efficace du FACS fournit trois outils distincts qui sont utiles pour les études de biologie cellulaire : 1) la description morphologique et fonctionnelle des cellules simples ; 2) l’identification, la séparation et l’isolement de populations cellulaires spécifiques pour des études en aval; et 3) l’analyse des tests fonctionnels au niveau de la cellule unique.

Le développement et l’application de divers marqueurs fluorescents exogènes pour l’étude des cellules coralliennes restent presque inexplorés. Ces marqueurs peuvent inclure des protéines étiquetées, des substrats marqués pour les enzymes ou des réponses fluorescentes à d’autres composés. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les types de cellules qui ont des propriétés uniques, telles que la mise en évidence des cellules qui produisent des quantités variables d’une fonction spécifique compartiment cellulaire, comme les lysosomes. Un autre exemple est l’utilisation de perles étiquetées fluorescentes pour identifier fonctionnellement les cellules compétentes pour la phagocytose, ou l’engloutissement d’un agent pathogène ciblé²⁵. Les populations de cellules actives dans les réponses immunitaires peuvent être facilement identifiées par FACS après l’engloutissement de ces perles exogènement appliquées. Tandis que les méthodes histologiques traditionnelles exigent le tissu préservé et beaucoup d’heures pour approximativer le pourcentage de cellules positives pour l’engloutissement de perle, un essai fonctionnel de FACS pour l’engloutissement d’agent pathogène peut être exécuté relativement rapidement sur des cellules vivantes isolées. En plus d’étudier les réponses spécifiques aux cellules au stress, cette technologie a le potentiel de clarifier l’expression spécifique aux gènes et d’éclairer l’histoire évolutive et développementale des types cellulaires entièrement uniques aux cnidarians, tels que les calicoblastes et les cnidocytes.

Récemment, nous avons effectué un dépistage intensif de plus de 30 marqueurs cellulaires qui ont abouti à l’identification de 24 qui sont capables d’étiqueter les cellules coralliennes, dont 16 sont utiles pour distinguer les populations uniques¹⁸, ce qui en fait des grappes de différenciation (CD). Ici, nous décrivons le processus d’isolement des cellules coralliennes dans pocillopora damicornis de l’enlèvement des cellules du squelette de carbonate de calcium à l’identification et l’isolement de populations cellulaires spécifiques avec FACS (figure 1).

Protocol

1. Dissociation des tissus du squelette de corail par aérographe et compresseur REMARQUE : Effectuez des marches sur la glace et protégez les mains avec des gants. Assembler le kit d’aérographe en connectant le compresseur d’air, le tuyau et l’aérographe(figure 2). Réglez la jauge de pression entre 276 et 483 kPa.REMARQUE : Le compresseur et le tuyau d’air recommandés pour cette étude ont été prédéfinis à une pression maximale de …

Representative Results

Dans l’ensemble, ce protocole est utile parce qu’il facilite l’identification et la collecte des populations vivantes de cellules coralliennes qui peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Le flux de travail a commencé avec la séparation mécanique des tissus coralliens du squelette sous-jacent de carbonate de calcium(figure 1). Il s’agit de l’une des étapes initiales les plus importantes parce que la technique incorrecte entraî…

Discussion

Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.¹⁸ et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la p…

Materials

Airbrush Kit & Compressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria II	BD	644832
Bone Cutters	Bulk Reef Supply	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm
Collection bag	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemacytometer
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-294	1.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
Round-bottom tubes	VWR	352063	5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube
Syringe	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate