Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток
Summary
Кораллы создают биоразнообразные экосистемы, важные как для человека, так и для морских организмов. Тем не менее, мы до сих пор не понимаем весь потенциал и функции многих коралловых клеток. Здесь мы представляем протокол, разработанный для изоляции, маркировки и разделения популяций каменистых коралловых клеток.
Abstract
Коралловые рифы находятся под угрозой из-за антропогенных стрессов. Биологическая реакция кораллов на эти стрессоры может происходить на клеточном уровне, но механизмы не очень хорошо изучены. Для изучения реакции кораллов на стрессоры нам нужны инструменты для анализа клеточных реакций. В частности, нам нужны инструменты, которые облегчают применение функциональных анализов, чтобы лучше понять, как популяции клеток реагируют на стресс. В текущем исследовании мы используем флуоресцентную сортировку клеток (FACS) для изоляции и разделения различных популяций клеток в каменистых кораллах. Этот протокол включает в себя: (1) отделение коралловых тканей от скелета, (2) создание одноклеточной подвески, (3) маркировка коралловых клеток с использованием различных маркеров для цитометрии потока, и (4) gating и стратегии сортировки клеток. Этот метод позволит исследователям работать на кораллах на клеточном уровне для анализа, функциональных анализов и исследований экспрессии генов различных популяций клеток.
Introduction
Коралловые рифы являются одной из самых важных экосистем на Земле. Они облегчают биоразнообразие, обеспечивая критически ежимест для рыб и беспозвоночных и имеют решающее значение для поддержания антропогенных сообществ путем обеспечения продовольствием и экономическими средствами к существованию через туризм1. Как ключевой строитель коралловых рифов, коралловые животные (Phylum: Cnidaria) также помогает прибрежных общин, создавая большие карбонат кальция рамки, которые смягчают волны и шторм повреждения2.
Кораллы, как взрослые sessile животных, которые принимают широкий спектр эндосимбиотических партнеров, в том числе вирусов, археи, бактерий, протеистов, грибов, и, прежде всего, члены водорослей dinoflagellate семьи Symbiodiniaceae3. Изменения в окружающей среде могут вызвать дисбаланс в этом сообществе, часто приводит к вспышкам болезней и обесцвечивания кораллов, в которых симбиотические Symbiodiniaceae изгнаны из коралловой колонии, тем самым устраняя основной источник питания для кораллов. Оба этих сценария часто приводят к гибели кораллового хозяина4,,5,,6. Воздействие антропогенных индуцированных стрессоров, таких как быстрое изменение климата, ускоряют массовые явления смерти кораллов, что приводит к глобальному упадку коралловых рифов7.
В последнее время было разработано множество различных методов, чтобы помочь смягчить потерю коралловых рифов. Эти методы включают в себявысадкю кораллов на существующих рифах, генетическое пересечение с использованием термически толерантных генотипов, а также клеточные манипуляции микробных и симбиотических сообществ, размещенных в кораллах8,9. Несмотря на эти усилия, многое остается неизвестным о разнообразии коралловых клеток и функции клеток10,11,,12,13. Для понимания того, как ведет себя коралловый организм в нормативных и стрессовых условиях, необходимо глубокое понимание разнообразия типа коралловых клеток и функции клеток. Усилия по максимальному восстановлению и эффективности сохранения выиграют от более глубокого понимания того, как разнообразие клеток и функции генов связаны между собой.
Предыдущая работа по разнообразию и функции клеток в первую очередь была сосредоточена на гистологических исследованиях и целую ткань РНК выборки14,15,,16,17. Для получения более подробной информации о конкретных функциях типа клеток в кораллах должны быть методы изоляции конкретных популяций живых коралловых клеток. Это было сделано успешно в неклассических модель организмов с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) поток цитометрии технологии18. FACS использует комбинацию лазеров, настроенных на различные длины волн для измерения различных эндогенных клеточных свойств на уровне одной клетки, таких как относительный размер клеток, детализация клеток и автофлуоресценция. Кроме того, клетки могут быть отмечены флуоресцентно маркированных соединений для измерения конкретных, желаемых свойств18,19.
До сих пор применение цитометрии потока к коралловым клеткам в основном было для анализа симбиотических Symbiodiniaceae и других бактериальных популяций, используя их сильные, естественные автофлюоресценции20,21,22. FACS также был использован для оценки размера генома кораллов с помощью флуоресцентного сигнала маркера ДНК по сравнению с эталонной моделью клеток организма23,24. Эффективное применение FACS предоставляет три различных инструмента, которые полезны для исследований клеточной биологии: 1) морфологическое и функциональное описание одиночных клеток; 2) идентификация, разделение и изоляция конкретных популяций клеток для исследований ниже по течению; и 3) анализ функциональных анализов на уровне одной клетки.
Разработка и применение различных экзогенных флуоресцентных маркеров для изучения коралловых клеток остается практически неизученной. Такие маркеры могут включать помеченные белки, помеченные субстраты для ферментов или флуоресцентные реакции на другие соединения. Эти маркеры могут быть использованы для определения типов клеток, которые имеют уникальные свойства, такие как выделение клеток, которые производят различное количество конкретной функции клеточного отсека, как лисосомы. Дополнительным примером является использование флуоресцентно помеченных бусинок для функциональной идентификации клеток, компетентных для фагоцитоза, или поглощения целевого патогена25. Популяции клеток, активных в иммунных реакциях, могут быть легко идентифицированы FACS после поглощения этих экзогенно применяемых бусинок. В то время как традиционные гистологические методы требуют сохранения ткани и много часов, чтобы приблизить процент клеток, положительных для биса поглощения, на основе FACS функциональный анализ для патогена поглощения может быть выполнена относительно быстро на изолированных живых клеток. В дополнение к изучению клеточных ответов на стресс, эта технология имеет потенциал для уточнения генно-специфической экспрессии и осветить эволюционную и историю развития типов клеток, полностью уникальных для книдарян, таких как каликобласты и cnidocytes.
Недавно мы провели интенсивный скрининг более 30 клеточных маркеров, что привело к выявлению 24, которые способны маркировки коралловых клеток, 16 из которых полезны для различения уникальных популяций18, что делает их кластеров дифференциации (CD). Здесь мы описываем процесс изоляции коралловых клеток в Pocillopora damicornis от удаления клеток из карбоната кальция скелета для идентификации и изоляции конкретных популяций клеток с FACS (Рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол был адаптирован из Rosental et al.18 и разработан для идентификации и изоляции клеток P. damicornis. Методология фокусируется на процессе фильтрации образцов для удаления мусора, нежизнеспособных клеток и клеток Symbiodiniaceae путем изучения внутренних факторов клеток, вк…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK хотел бы отметить Университет Майами исследований Награды в области естественных наук и техники для финансирования этого исследования. BR хотел бы поблагодарить Алекса и Энн Лаутербах за финансирование Сравнительной и Эволюционной Иммунологической Лаборатории. Работа BR была поддержана номерами Израильского научного фонда (ISF): 1416/19 и 2841/19, и Грантом hFSP Research Grant, RGY0085/2019. Мы хотели бы поблагодарить за техническую помощь за техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Университет Майами, Миллер школы медицины потока цитометрии Общий ресурс в Сильвестр Всеобъемлющего онкологического центра для доступа к цитометру FACS и Шеннон Сай для технической поддержки.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
Referencias
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
