תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין
Summary
האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.
Abstract
שוניות אלמוגים נמצאות תחת איום. עקב אנתרופוגניים שתוקפים התגובה הביולוגית של האלמוג לאותם לחצים עלולה להתרחש ברמה התאית, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. כדי לחקור את תגובת האלמוגים לתוקפים, אנו זקוקים לכלים לניתוח תגובות סלולריות. במיוחד, אנחנו צריכים כלים המאפשרים את היישום של מוסר פונקציונלי להבין טוב יותר כיצד אוכלוסיות תאים מגיבים ללחץ. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים במיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) כדי לבודד ולהפריד אוכלוסיות תאים שונות באלמוגים אבן. פרוטוקול זה כולל: (1) הפרדת רקמות האלמוגים מן השלד, (2) היצירה של השעיית תא יחיד, (3) תיוג התאים האלמוגים באמצעות סמנים שונים עבור הזרמת cy, ו (4) מיון ואסטרטגיות המיון תאים. שיטה זו תאפשר לחוקרים לעבוד על אלמוגים ברמה התאית לניתוח, משפט פונקציונלי, ולימודי גנים של אוכלוסיות תאים שונות.
Introduction
שוניות אלמוגים הן אחת. האקולוגיות החשובות בעולם הם מאפשרים ביולוגי על ידי מתן בתי גידול קריטיים לדגים וחסרי חוליות והם חיוניים לקיום קהילות אנתרופוגניים על ידי מתן מזון ופרנסה כלכלית באמצעות התיירות1. כמו בונה המפתח של שוניות אלמוגים, בעלי חיים אלמוג (Phylum: Cנדבך) גם מסייע לקהילות החוף על ידי יצירת מסגרות סידן פחמתי גדול ההקלת הנזק גל וסערה2.
אלמוגים כמו מבוגרים הם בעלי חיים sessile המארחים מגוון רחב של שותפים אנדוסימביוזה, כולל וירוסים, ארכאונים, חיידקים, protists פטריות, ובעיקר, חברים של פריחת אצות dinoflagellate משפחה Symbiodiniaceae3. שינויים בסביבה יכולים לגרום לחוסר איזון בקהילה זו, המובילה לעתים קרובות להתפרצויות של מחלות והלבנת אלמוגים שבה מגורשים הSymbiodiniaceae הסימביוטיים ממושבת האלמוגים, ובכך מבטלים את המקור העיקרי של תזונה לאלמוגים. שני תרחישים אלה לעתים קרובות לגרום למוות של מארח האלמוג4,5,6. השפעות אנתרופוגניים המושרה, כגון שינוי האקלים המהיר, הם האצת אירועי מוות של קורל המוני, המוביל לירידה גלובלית של שוניות האלמוגים7.
לאחרונה, הרבה שיטות שונות פיתחנו לסייע בהפחתת אובדן שונית האלמוגים. שיטות אלה כולל שתילת אלמוגים על שוניות קיימות, מעבר גנטי באמצעות גנוטיפים עמידים בפני חום, ותפעול הסלולר של החיידקים וקהילות סימביוטי אירח בתוך האלמוג8,9. למרות המאמצים הללו, הרבה נשאר לא ידוע על הגיוון תא אלמוגים ותפקוד התא10,11,12,13. הבנה יסודית של סוג תא אלמוגים מגוון ותפקוד התא הוא הכרחי כדי להבין כיצד האורגניזם האלמוג מתנהג בתנאים נורמטיביים ומלחיצים. המאמצים כדי למקסם את יעילות השיקום והשימור ייהנו מהבנה משופרת של איך תאים גיוון ותפקוד גנטי מצמידים.
העבודה הקודמת על תא גיוון ותפקוד התמקד בעיקר במחקרים היסטלוגיים ו-RNA רקמות שלמות בדגימה14,15,16,17. כדי לקבל פרטים רבים יותר על פונקציית סוג תא מסוימת באלמוגים, יש להיות שיטות לבידוד של אוכלוסיות מסוימות של תאי אלמוגים חיים. זה נעשה בהצלחה באורגניזמים שאינם קלאסיים מודל באמצעות מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) זרם cy, לנסות הטכנולוגיה18. FACS מנצל שילוב של לייזרים מכוונים אורכי גל משתנים כדי למדוד תכונות הסלולר שונים ברמת תא בודד כגון גודל התא היחסי, צפיפות התא, ו-פלואורסצנטית אוטומטי. בנוסף, התאים עשויים להיות מסומנים על-ידי התרכובות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים כדי למדוד מאפיינים ספציפיים ורצויים18,19.
עד כה, היישום של הזרמת cy, לתאי אלמוגים הייתה בעיקר לניתוח של שיתופי Symbiodiniaceae ואוכלוסיות בקטריאלי אחרות על ידי ניצול חזק, טבעי שלהם האוטוקטנטית20,21,22. Facs יש גם שימש כדי להעריך את גודל הגנום אלמוג באמצעות אות ה-DNA הפלורסנט סמן לעומתהתייחסות מודלאורגניזם תאים23,24. היישום היעיל של FACS מספק שלושה כלים ברורים השימושיים עבור לימודי ביולוגיה של התא: 1) תיאור מורפולוגיים ופונקציונלי של תאים בודדים; 2) זיהוי, הפרדה ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עבור לימודי במורד הזרם; ו-3) ניתוח ההסכמה הפונקציונלית במפלס התא הבודד.
פיתוח ויישום של סמני פלורסנט שונים לחקר התאים האלמוגים נשאר כמעט נחקרו. סמנים כאלה עשויים לכלול חלבונים מתויגים, מתויג מצעים עבור אנזימים, או תגובות פלורסנט לתרכובות אחרות. ניתן להשתמש בסמנים אלה כדי לזהות סוגי תאים בעלי מאפיינים ייחודיים, כגון הדגשת תאים המייצרים כמויות שונות של תכונה מסוימת של תא תאי, כמו ליסוזומים. דוגמה נוספת היא השימוש בחרוזים בעלי תוויות פלואורוסקופים כדי לזהות מבחינה פונקציונלית תאים המוסמכים עבור phagocyציטוזה, או הבשלה של הפתוגן ממוקד25. אוכלוסיות של תאים הפעילים בתגובות חסינות ניתן לזהות בקלות על ידי FACS לאחר שתבלע את החרוזים האלה להחיל באופן שלאחר. בעוד שיטות היסטולוגית מסורתיות דורשות רקמה שנשמרה ושעות רבות כדי לקירוב אחוז התאים חיובי עבור חרוז השחב, מבוסס FACS מבוססי פונקציונליות תפקודית עבור הפתוגן שתבלע ניתן לבצע במהירות יחסית על תאים חיים מבודדים. בנוסף ללימוד תגובות התאים הספציפיים ללחץ, טכנולוגיה זו יש פוטנציאל להבהיר ביטוי גנטי ספציפי ולהאיר את ההיסטוריה ההתפתחותית של סוגי תאים ייחודיים לחלוטין לקטענים, כגון calicoblasts חזיק ו cnidocציטים.
לאחרונה, ביצעו הקרנה אינטנסיבית של מעל 30 סמנים סלולריים שגרמו לזיהוי 24 כי הם מסוגלים לתייג תאים אלמוג, 16 מהם שימושיים להבחנה בין אוכלוסיות ייחודיות18, מה שהופך אותם אשכולות של בידול (CD). כאן אנו מתארים את התהליך של בידוד תא אלמוגים ב Pocillopora damicornis מהסרת תאים משלד סידן פחמתי לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עם facs (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הותאם מרוסנטל ואח ‘בן 18 והתפתח לזיהוי ולבידוד של התאים המדמוליים . המתודולוגיה מתמקדת בתהליך של סינון דגימות כדי להסיר פסולת, תאים שאינם קיימא, ו-Symbiodiniaceae תאים מתארחים באמצעות בחינת גורמים פנימיים תא, כולל גודל תא יחסי, צפיפות תא יחסי, התאים האוטומטיים של התא, ו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK מעוניין להכיר בפרסי המחקר של אוניברסיטת מיאמי במדעי הטבע והנדסה למימון מחקר זה. BR רוצה להודות לאלכס ואן נשקף על מימון המעבדה השוואתית והאבולוציונית לאימונולוגיה. עבודתו של BR נתמכת על ידי מספרי הקרן הלאומית למדע: 1416/19 ו-2841/19, ו-HFSP מלגת מחקר, RGY0085/2019. אנחנו רוצים להודות לזחנה קוז’קאבה ולמייק קונלי לסיוע טכני. היינו גם רוצים להודות לאוניברסיטת מיאמי, בית הספר מילר של זרימה cy, מחלקת הרפואה של משאבים משותפים במרכז הסרטן סילבסטר מקיף לקבלת גישה לציטוטוטר FACS ו שאנון סאין לתמיכה טכנית.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
Referencias
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
