Quantification de l’adhérence des cellules tumorales dans les cryosections des ganglions lymphatiques
Summary
Ici, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse qui permet la quantification des cellules adhésives de tumeur aux cryosections de ganglion lymphatique (LN). Les cellules de tumeur LN-adhérentes sont facilement identifiées par microscopie légère et confirmées par une méthode fluorescence-basée, donnant un index d’adhérence qui indique l’affinité de cellule-contraignante de tumeur au parenchyme de LN.
Abstract
Les ganglions lymphatiques drainant les tumeurs (LN) ne sont pas seulement des filtres de déchets tumoraux. Ils sont l’un des sites régionaux les plus communs de résidence provisoire des cellules de tumeur disséminées dans les patients présentant différents types de cancer. La détection de ces cellules tumorales LN-résidantes est un biomarqueur important lié au pronostic pauvre et aux décisions adjuvantes de thérapie. Des modèles récents de souris ont indiqué que les cellules tumorales LN-résidantes pourraient être une source substantielle de cellules malignes pour les métastases lointaines. La capacité de quantifier l’adhérence des cellules tumorales au parenchyme LN est une jauge critique dans la recherche expérimentale qui se concentre sur l’identification des gènes ou des voies de signalisation pertinentes pour la diffusion lymphatique/métastatique. Parce que les LN sont des structures 3D complexes avec une variété d’apparences et de compositions dans les sections tissulaires selon le plan de la section, leurs matrices sont difficiles à reproduire expérimentalement in vitro d’une manière entièrement contrôlée. Ici, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse qui permet la quantification des cellules adhésives de tumeur aux cryosections de LN. En utilisant des sections sériedes de la même LN, nous adaptons la méthode classique développée par Brodt pour utiliser des étiquettes non radioactives et comptons directement le nombre de cellules tumorales adhérant par surface ln. Les cellules tumorales adhérentes à LN sont facilement identifiées par microscopie légère et confirmées par une méthode basée sur la fluorescence, donnant un indice d’adhérence qui révèle l’affinité cell-contraignante au parenchyme de LN, qui est l’évidence suggestive des altérations moléculaires dans la liaison d’affinité des intégrines à leurs LN-ligands corrélés.
Introduction
La métastes du cancer est la principale raison de l’échec du traitement et l’aspect dominant du cancer qui met la vie en danger. Comme postulé il y a 130 ans, la propagation métastatique résulte quand une élite de cellules tumorales disséminées (DTC, les « graines ») acquièrent des capacités biologiques spécifiques qui leur permettent d’échapper aux sites primaires et d’établir une croissance maligne à des sites éloignés (le « sol »)1. Récemment, plusieurs concepts nouveaux concernant les relations « semences et sols » ont vu le jour, tels que l’induction de niches prémétastatiques (conceptualisées comme « sol fertile » nécessaires à la croissance des « graines »), l’auto-ensemencement des tumeurs primaires par les DTC, la dormance des « graines » dans les organes secondaires et le modèle de progression parallèle de la métastase2.
Pour la plupart des tumeurs malignes solides, les DTC peuvent résider et être détectés dans de nombreux organes mésenchymales, tels que la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques (LN) chez les patients atteints ou sans preuve de métastes cliniques. Puisque les LN de tumeur-vidant sont le premier emplacement de la propagation régionale des DTCs, le statut de LN est un indicateur pronostique important et est souvent associé aux décisions adjuvantes de thérapie3. Pour certains types de tumeurs, la corrélation entre l’état LN et les pires résultats est forte, y compris la tête et le cou4,5, sein6, prostate7, poumon8, gastrique9, colorectal10,11 et les cancers de la thyroïde12.
Les LN sont de petits organes ovoïdes du système lymphatique, qui sont couverts de cellules réticulaires et enfermés avec des vaisseaux lymphatiques. Ces organes sont absolument nécessaires au fonctionnement du système immunitaire13. Les LN agissent comme des plates-formes d’attraction pour les cellules flottantes immunitaires, rassemblant les lymphocytes et les cellules antigènes-présentant ensemble14. Cependant, les LN attirent également les cellules tumorales circulantes. Au fil des décennies, les LN ont été représentés comme des voies passives de transport pour les cellules tumorales métastatiques. Cependant, des études récentes ont indiqué que les cellules tumorales peuvent également être guidées vers les LN par des indices chimiothérapeutiques (chemokines) et/ou haptotactiques (éléments de matrice extracellulaire) sécrétés par l’endothélium lymphatique15. À titre d’exemples, la surexpression du récepteur CCR7 dans les cellules tumorales facilite le guidage des cellules métastatiques du mélanome vers les LN drainant la tumeur16. En outre, les protéines lN extracellulaires fournissent un échafaudage adhésif pour le recrutement et la survie des cellules tumorales circulantes17. En fait, les LN drainant les tumeurs fournissent un sol fertile pour l’ensemencement des DTC, qui peuvent être maintenus dans des états proliférants ou dormants par des signaux microenvironnementaux LN spécifiques18. Le sort final de ces DTC résidant en LN est controversé; certains travaux suggèrent que ces cellules sont des indicateurs passifs de progression métastatique19, tandis que d’autres proposent qu’elles sont plus susceptibles d’être les fondateurs de la résistance (en auto-ensemencement des sites primaires) et / ou agissent comme réservoirs cellulaires pour les métastases (propagation de «graines» pour la croissance du cancer tertiaire)20,21. Récemment, à l’aide de modèles précliniques, il a été démontré qu’une fraction de ces DTC résidant en LN ont activement envahi les vaisseaux sanguins, sont entrés dans la circulation sanguine et ont colonisé les poumons21.
Considérant que la présence de cellules cancéreuses dans les LN est un marqueur pour l’agressivité et l’invasivité de cancer, dans cette étude, nous avons optimisé une méthode classique développée par Brodt22 pour mesurer quantitativement l’adhérence de cellules de tumeur aux LNs in vitro. L’utilisation d’un test à base de fluorescence nous a permis de développer un protocole peu coûteux, rapide, sensible et respectueux de l’environnement (non radioactif) pour la détection des altérations adhésives entre les cellules tumorales et les cryosections LN. Utilisant les cellules de cancer du sein de MCF-7 exprimant différents niveaux de l’expression de gène de NDRG4 et des sections congelées de rat LN pour illustrer la méthode, nous avons prouvé que ce protocole a permis une bonne corrélation entre l’adhérence de cellules de tumeur aux LNs in vitro et métastasis de LN observés dans les patients de cancer du sein24.
Protocol
Representative Results
Discussion
La dissémination du système lymphatique des cellules cancéreuses nécessite une variété d’événements complexes dirigés par des cellules. Ils commencent avec le détachement cellulaire de la tumeur primaire et le remodelage de l’architecture extracellulaire de matrice (ECM), et sont soutenus par la chimiotaxis persistante et la migration active par les lymphatiques afférents en route aux LNs sentinelles. Si les cellules cancéreuses adhèrent et survivent dans les LN, elles peuvent facilement se propager à d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Rosana De Lima Pagano et Ana Carolina Pinheiro Campos pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de: FAPESP – Fondation de recherche de Sao Paulo (2016/07463-4) et Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Referencias
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