Quantifizierung der Tumorzelladhäsion in Lymphknoten-Kryosektionen
Summary
Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu Lymphknoten (LN) Kryosektionen ermöglicht. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, die einen Haftindex ergibt, der die Tumorzellbindungsaffinität zu LN-Parenchym offenbart.
Abstract
Tumorabflussende Lymphknoten (LNs) sind nicht nur Filter von tumorerzeugten Abfällen. Sie sind einer der häufigsten regionalen Standorte des vorläufigen Wohnsitzes von disseminierten Tumorzellen bei Patienten mit verschiedenen Krebsarten. Der Nachweis dieser LN-lebenden Tumorzellen ist ein wichtiger Biomarker, der mit schlechten Prognose- und adjuvanten Therapieentscheidungen verbunden ist. Jüngste Mausmodelle haben gezeigt, dass LN-lebende Tumorzellen eine wesentliche Quelle bösartiger Zellen für entfernte Metastasen sein könnten. Die Fähigkeit, die Verklebung von Tumorzellen mit LN Parenchym zu quantifizieren, ist ein kritisches Maß in der experimentellen Forschung, das sich auf die Identifizierung von Genen oder Signalwegen konzentriert, die für die lymphatische/metastasierende Verbreitung relevant sind. Da LNs komplexe 3D-Strukturen mit einer Vielzahl von Erscheinungen und Zusammensetzungen in Gewebeabschnitten sind, abhängig von der Ebene des Abschnitts, sind ihre Matrizen schwierig, experimentell in vitro in einer vollständig kontrollierten Weise zu replizieren. Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Methode, die die Quantifizierung von klebenden Tumorzellen zu LN-Kryosektionen ermöglicht. Mit seriellen Abschnitten desselben LN passen wir die von Brodt entwickelte klassische Methode an nicht radioaktive Etiketten an und zählen direkt die Anzahl der haftenden Tumorzellen pro LN-Oberfläche. LN-anhängliche Tumorzellen werden leicht durch Lichtmikroskopie identifiziert und durch eine fluoreszenzbasierte Methode bestätigt, was einen Haftungsindex ergibt, der die zellbindende Affinität zu LN-Parenchym offenbart, was ein suggestiver Beweis für molekulare Veränderungen in der Affinitätsbindung von Integrinen an ihre korrelierten LN-Liganden ist.
Introduction
Krebsmetastasen sind der Hauptgrund für Behandlungsversagen und der vorherrschende lebensbedrohliche Aspekt von Krebs. Wie vor 130 Jahren postuliert, entsteht die metastasierende Ausbreitung, wenn eine Elite von verbreiteten Tumorzellen (DTCs, die “Samen”) spezifische biologische Fähigkeitenerwerben, die es ihnen ermöglichen, primäre Standorte zu umgehen und bösartiges Wachstum an entfernten Stellen (dem “Boden”) zu etablieren 1 . In jüngster Zeit sind mehrere neuartige Konzepte über die “Samen- und Bodenbeziehungen” entstanden, wie die Induktion prämetastatischer Nischen (konzeptioniert als “fruchtbarer Boden”, der für “Samen” benötigt wird, um zu gedeihen), die Selbstaussaat von Primärtumoren durch DTCs, “Samen”-Ruhe an sekundären Organen und das parallele Progressionsmodell der Metastasierung2.
Bei den meisten soliden Malignitäten können DTCs in vielen mesenchymalen Organen, wie Knochenmark und Lymphknoten (LNs) bei Patienten mit oder ohne Nachweis klinischer Metastasierung, residieren und nachgewiesen werden. Da tumorabflussende LNs der erste Standort der regionalen Verbreitung von DTCs sind, ist der LN-Status ein wichtiger prognostischer Indikator und wird oft mit adjuvanten Therapieentscheidungen in Verbindung gebracht3. Bei einigen Tumortypen ist die Korrelation zwischen LN-Status und schlechteren Ergebnissen stark, einschließlich Kopf und Hals4,5, Brust6, Prostata7, Lunge8, Magen9, kolorektal10,11 und Schilddrüsenkrebs12.
LNs sind kleine eiförmige Organe des Lymphsystems, die mit Netzzellen bedeckt und mit Lymphgefäßen umschlossen sind. Diese Organe sind absolut notwendig für die Funktion des Immunsystems13. LNs fungieren als Anziehungsmittel plattformen für immun zirkulierende Zellen und bringen die Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen zusammen14. Jedoch, LNs ziehen auch zirkulierende Tumorzellen. Über Jahrzehnte wurden LNs als passive Transportwege für metastasierende Tumorzellen dargestellt. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Tumorzellen auch durch chemotaktische (Chemokine) und/oder haptotaktische (extrazelluläre Matrixelemente) vom lymphatischen Endothel15sezernierte Cues zu LNs geführt werden können. Als Beispiele erleichtert die Überexpression des CCR7-Rezeptors in Tumorzellen die Führung metastasierender Melanomzellen hin zu tumorableitenden LNs16. Darüber hinaus bieten extrazelluläre LN-Proteine ein Klebegerüst für die Rekrutierung und das Überleben zirkulierender Tumorzellen17. Tatsächlich liefern tumorableitende LNs fruchtbaren Boden für die Aussaat von DTCs, die in proliferativen oder ruhenden Zuständen durch spezifische LN-Mikroumweltsignale gehalten werden können18. Das endgültige Schicksal dieser LN-wohnhaften DTCs ist umstritten; Einige Arbeiten deuten darauf hin, dass diese Zellen passive Indikatoren für die metastasierende Progressionsind 19, während andere vorschlagen, dass sie eher Gründer von Resistenzen sind (durch selbstsäende primäre Standorte) und/oder als zelluläre Reservoirs für Metastasen fungieren (Verbreitung von “Samen” für tertiäres Krebswachstum)20,21. Kürzlich wurde mit präklinischen Modellen nachgewiesen, dass ein Bruchteil dieser LN-wohnhaften DTCs aktiv in Blutgefäße eingedrungen ist, in den Blutkreislauf gelangt eist und die Lunge kolonisiert hat21.
In Anbetracht der Tatsache, dass das Vorhandensein von Krebszellen in LNs ein Marker für Krebsaggressivität und Invasivität ist, haben wir in dieser Studie eine klassische Methode optimiert, die von Brodt22 entwickelt wurde, um die Adhäsion von Tumorzellen an LNs in vitro quantitativ zu messen. Die Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays ermöglichte es uns, ein kostengünstiges, schnelles, empfindliches und umweltfreundliches (nicht radioaktives) Protokoll zum Nachweis von Klebstoffveränderungen zwischen Tumorzellen und LN-Kryosektionen zu entwickeln. Mit den MCF-7 Brustkrebszellen, die verschiedene Niveaus der NDRG4-Genexpression und Ratten-LN-Frozen-Abschnitte exdrücken, um die Methode zu veranschaulichen, zeigten wir, dass dieses Protokoll eine gute Korrelation zwischen der Adhäsion von Tumorzellen zu LNs in vitro und LN-Metastasen, die bei Brustkrebspatientinnen beobachtet wurden, ermöglichte24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verbreitung von Krebszellen durch das Lymphsystem erfordert eine Vielzahl komplexer zellgesteuerter Ereignisse. Sie initiieren mit Zellablösung vom Primärtumor und der Umgestaltung der extrazellulären Matrixarchitektur (ECM) und werden durch anhaltende Chemotaxis und aktive Migration durch die affeligen Lymphatiken auf dem Weg zu den Sentinel-LNs unterstützt. Wenn Krebszellen in LNs haften und überleben, können sie sich leicht auf andere Sekundärorgane ausbreiten. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Rosana De Lima Pagano und Ana Carolina Pinheiro Campos für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien von: FAPESP – Sao Paulo Research Foundation (2016/07463-4) und Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) unterstützt.
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Referencias
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