リンパ節凍結部における腫瘍細胞接着の定量
Summary
ここでは、接着性腫瘍細胞をリンパ節(LN)凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する腫瘍細胞結合親和性を明らかにする接着指数を与える。
Abstract
腫瘍排出リンパ節(LN)は、腫瘍が産生する廃棄物のフィルターだけではありません。彼らは、異なるタイプの癌患者における播種腫瘍細胞の暫定的な居住地の最も一般的な地域サイトの1つである。これらのLN存在性腫瘍細胞の検出は、予後不良およびアジュバント療法の決定に関連する重要なバイオマーカーである。最近のマウスモデルは、LN-常駐腫瘍細胞が遠隔転移のための悪性細胞の実質的な供給源であり得る可能性を示している。LN parenchymaに対する腫瘍細胞の接着性を定量化する能力は、リンパ/転移に関連する遺伝子またはシグナル伝達経路の同定に焦点を当てた実験研究において重要なゲージである。LNは、断面の平面に応じて組織セクション内の様々な外観および組成物を有する複雑な3D構造であるため、それらの行列は完全に制御された方法で実験的にインビトロで複製することは困難である。ここでは、粘着腫瘍細胞をLN凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。同じLNのシリアルセクションを使用して、我々は非放射性ラベルを使用し、直接LN表面積あたりの接着腫瘍細胞の数を数えるためにBrodtによって開発された古典的な方法を適応させます。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する細胞結合親和性を明らかにする接着性を示す接着指数を与え、インテグリンとそれらの相関性LN-リガンドへの結合における分子変化の示唆的証拠である。
Introduction
癌転移は、治療の失敗の主な理由であり、癌の支配的な生命を脅かす側面である。130年前に仮定したように、転移性拡散は、普及した腫瘍細胞(DTC、種子)のエリートが、彼らが一次部位を回避し、遠くの部位(「土壌」)で悪性成長を確立することを可能にする特定の生物学的能力を獲得したときに生じる(「土壌」)1。近年、前転移性ニッチの誘導(「種子」が繁栄するために必要な「肥沃な土壌」として概念化された)、DCによる原発性腫瘍の自己播種、二次臓器での「種子」休眠、転移2の並行進行モデルなど、「種子と土壌」関係に関するいくつかの新しい概念が出現している。
ほとんどの固形悪性腫瘍では、DTCは、臨床転移の有無にかかわらず、骨髄およびリンパ節(LN)のような多くの間葉器官に存在し、検出することができる。腫瘍流出のLNは、DTCの地域的な広がりの最初の場所であるため、LNステータスは重要な予後指標であり、しばしばアジュバント療法の決定に関連付けられている3。いくつかの腫瘍タイプに対して、LNの状態と悪い結果との間の相関は強く、頭頸部4、5、乳房6、前立腺7、肺8、胃9、大腸10、11および甲状腺癌12を含む。
LNは、網状細胞で覆われ、リンパ管で囲まれたリンパ系の小さな卵器官である。これらの器官は、免疫系13の機能のために絶対に必要である。LNは、免疫循環細胞の誘引プラットフォームとして機能し、リンパ球と抗原提示細胞を14個集める。しかし、LNはまた、循環腫瘍細胞を引き付ける。何十年もの間、Nは転移性腫瘍細胞の受動的な輸送ルートとして描かれました。しかし、最近の研究では、腫瘍細胞は、リンパ系内皮15によって分泌される化学療法(ケモカイン)および/またはハプトタクティク(細胞外マトリックス要素)キューによってLNに誘導される可能性も示されている。例として、腫瘍細胞におけるCCR7受容体の過剰発現は、腫瘍流出性LN16に対する転移性黒色腫細胞の誘導を容易にする。また、細胞外LNタンパク質は、循環腫瘍細胞17のリクルートおよび生存のための接着足場を提供する。実際、腫瘍流出LNは、特定のLN微小環境信号18によって増殖状態または休眠状態で維持することができるDTCの播種のための肥沃な土壌を提供する。LN に居住するこれらの DTC の最終的な運命は議論の余地があります。いくつかの作品は、これらの細胞が転移進行19の受動的な指標であることを示唆しているが、他の人は、彼らが抵抗性の創始者である可能性が高いことを提案する(自己播種一次部位によって)および/または転移のための細胞貯蔵所として作用する(第三次癌の成長のための「種子」を広げる)20、21。最近、前臨床モデルを用いて、これらのLN居住DCの一部が積極的に血管に侵入し、血液循環に入り、肺21を植民地化することが実証されている。
この研究では、RNにおけるがん細胞の存在が癌の攻撃性と侵襲性のマーカーであることを考慮して、Brodt22が開発した古典的な方法を最適化し、インビトロでのLNに対する腫瘍細胞接着を定量的に測定した。蛍光ベースのアッセイを使用することで、腫瘍細胞とLN凍結細胞間の接着変化の検出のための低コスト、迅速、高感度、環境に優しい(非放射性)プロトコルを開発することができました。この方法を例示するために異なるレベルのNDRG4遺伝子発現およびラットLN凍結切片を発現するMCF−7乳癌細胞を用いて、このプロトコルが乳癌患者24で観察されたインビトロにおけるLNsとLN転移に対する腫瘍細胞接着との良好な相関関係を認めた。
Protocol
Representative Results
Discussion
がん細胞のリンパ系普及には、さまざまな複雑な細胞駆動の事象が必要です。原発性腫瘍からの細胞剥離と細胞外マトリックス(ECM)アーキテクチャの再構築を開始し、センチネルLNへの途中で持続性走化と積極的なリンパ球を介した活発な移動によって支えられている。がん細胞が付着して、NNで生き残った場合、他の二次臓器に容易に広がることができます。ここでは、腫瘍細胞と凍結したL…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ロサナ・デ・リマ・パガーノ博士とアナ・カロライナ・ピニェイロ・カンポスの技術支援に感謝します。この研究は、FAPESP – サンパウロ研究財団(2016/07463-4)とルートヴィヒがん研究所(LICR)からの助成金によって支援されました。
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
Referencias
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Investigación sobre el cáncer. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Investigación sobre el cáncer. 66 (10), 5151-5158 (2006).
