Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé
Summary
Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.
Abstract
Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et la gestion dans la pratique agricole pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les données sur la métabolomique fournissent une lecture de ces interactions à un moment donné et sont informatives sur le statut biochimique d’un organisme. En outre, les métabolites individuels ou des panneaux de métabolites peuvent être utilisés comme biomarqueurs précis pour la prévision et la gestion des rendements et de la qualité. Le métabolome végétal devrait contenir des milliers de petites molécules aux propriétés physicochimiques variées qui offrent une occasion de perspicacité biochimique sur les traits physiologiques et la découverte de biomarqueurs. Pour exploiter cela, l’un des principaux objectifs des chercheurs en métabolomique est de saisir autant de diversité physicochimique que possible au sein d’une seule analyse. Nous présentons ici une méthode de métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide-masse pour l’analyse du grain de blé cultivé sur le terrain. La méthode utilise le gestionnaire de solvant quaternary chromatographique liquide pour introduire une troisième phase mobile et combine un gradient traditionnel de phase inversée avec un gradient de lipide-amenable. La préparation des grains, l’extraction de métabolites, l’analyse instrumentale et les flux de travail de traitement des données sont décrits en détail. Une bonne précision de masse et la reproductibilité du signal ont été observées, et la méthode a donné environ 500 dispositifs biologiquement pertinents par mode d’ionisation. En outre, des signaux de fonction méabolite et lipidique significativement différents entre les variétés de blé ont été déterminés.
Introduction
Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et les pratiques de gestion dans l’agriculture pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les métabolites végétaux sont influencés par des facteurs tels que le génome, l’environnement (climat, précipitations, etc.) et dans un contexte agricole, la façon dont les cultures sont gérées (c.-à-d. l’épandage d’engrais, les fongicides, etc.). Contrairement au génome, le métabolome est influencé par tous ces facteurs et donc les données métabololomics fournit une empreinte biochimique de ces interactions à un moment donné. Il y a habituellement l’un des deux objectifs d’une étude basée sur la métabolomique : premièrement, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie de l’organisme et aider à expliquer le mécanisme de réponse à la perturbation (stress abiotique ou biotique) par rapport à la physiologie; et deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude. Dans les deux cas, le résultat de cette connaissance est une stratégie de gestion plus précise pour atteindre l’objectif d’améliorer la taille et la qualité des rendements.
Le métabolome végétal devrait contenir des milliersde petites molécules aux propriétés physicochimiques variées. À l’heure actuelle, aucune plateforme de métabololomie (principalement la spectrométrie de masse et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire) ne peut capturer le métabolome entier en une seule analyse. Le développement de ces techniques (préparation d’échantillons, extraction et analyse de métabolites), qui fournissent une couverture aussi importante que possible du métabolome au sein d’une seule série analytique, est un objectif clé pour les chercheurs en métaabolomique. Les analyses médabolomics non ciblées antérieures du grain de blé ont combiné les données de multiples séparations chromatographiques et les polarités d’acquisition et/ou l’instrumentation pour une plus grande couverture métabolome. Toutefois, cela a exigé que les échantillons soient préparés et acquis séparément pour chaque modalité. Par exemple, Beleggia et coll.2 ont préparé un échantillon dérivatisé pour l’analyse GC-MS des analytes polaires en plus de l’analyse GC-MS des analytes nonpolaires. Das et coll.3 ont utilisé des méthodes GC- et LC-MS pour améliorer la couverture dans leurs analyses; toutefois, cette approche nécessiterait généralement des préparations d’échantillons distinctes telles que décrites ci-dessus ainsi que deux plates-formes d’analyse indépendantes. Les analyses antérieures des céréales de blé à l’aide de GC-MS2,3,4 et LC-MS3,5 plates-formes ont donné 50 à 412 (55 identifiés) caractéristiques pour GC-MS, 409 pour les plates-formes combinées GC-MS et LC-MS et plusieurs milliers pour une analyse lipidomicique LC-MS5. En combinant au moins deux modes en une seule analyse, une couverture métabolome étendue peut être maintenue, augmentant la richesse de l’interprétation biologique tout en offrant des économies dans le temps et le coût.
Pour permettre la séparation efficace d’un large éventail d’espèces lipidiques par chromatographie de phase inversée, les méthodologies lipidiques modernes utilisent généralement une forte proportion d’isopropanol dans le solvant d’elution6, fournissant une commodité aux classes lipidiques qui pourraient autrement ne pas être résolues par la chromatographie. Pour une séparation efficace des lipides, la phase mobile de départ est également beaucoup plus élevée dans la composition organique7 que les méthodes chromatographiques de phase inversée typiques, qui considèrent d’autres classes de molécules. La composition organique élevée au début du gradient rend ces méthodes moins adaptées à de nombreuses autres classes de molécules. Plus particulièrement, la chromatographie liquide de phase inversée emploie un gradient de solvant binaire, commençant par une composition principalement aqueuse et augmentant dans la teneur organique pendant que la force d’elution de la chromatographie est augmentée. À cette fin, nous avons cherché à combiner les deux approches pour parvenir à la séparation des classes de lipides et non-lipidiques des métabolites au sein d’une seule analyse.
Ici, nous présentons une méthode chromatographique qui utilise une troisième phase mobile et permet une phase inversée traditionnelle combinée et une méthode de chromatographie lipidique appropriée à l’aide d’une seule préparation d’échantillon et d’une colonne analytique. Nous avons adopté bon nombre des mesures de contrôle de la qualité et des étapes de filtrage des données qui ont déjà été mises en œuvre dans des études méabolomics principalement cliniques. Ces approches sont utiles pour déterminer les caractéristiques robustes avec une recrétabilité technique élevée et la pertinence biologique et exclut celles qui ne répondent pas à ces critères. Par exemple, nous décrivons l’analyse répétée de l’échantillon8, qc correction9,données filtrant9,10 et l’imputation des entités manquantes11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une méthode de métabolomique non ciblée basée sur le LC-MS pour l’analyse du grain de blé. La méthode combine quatre modes d’acquisition (phase inversée et phase inversée lipidique avec ionisation positive et négative) en deux modes en introduisant une troisième phase mobile dans le gradient de phase inversée. L’approche combinée a produit environ 500 caractéristiques biologiquement pertinentes par polarité ion, dont environ la moitié d’intensité significativement différente…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient souligner le programme de bourses d’études sur l’agriculture et l’alimentation du premier ministre de l’Australie-Occidentale (Ministère de l’emploi, du tourisme, des sciences et de l’innovation, gouvernement de l’Australie-Occidentale) et du premier ministre, le professeur Simon Cook (Centre for Digital Agriculture, Curtin University et Murdoch University). Les essais sur le terrain et la collecte d’échantillons de céréales ont été appuyés par le programme Royalties for Regions du gouvernement de l’Australie-Occidentale. Nous remercions Grantley Stainer et Robert Français pour leur contribution aux essais sur le terrain. Bioplatforms Australia, financé par le NCRIS, est reconnu pour le financement de l’équipement.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referencias
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