Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo
Summary
Se presenta un método para el análisis no focalizado de metabolitos y lípidos de grano de trigo. El protocolo incluye un método de extracción de metabolito de acetonitrilo y una metodología de espectrometría de masas de cromatografía líquida de fase inversa, con adquisición en modos de ionización de electrospray positivo según lo negativo y negativo.
Abstract
Comprender las interacciones entre los genes, el medio ambiente y la gestión en la práctica agrícola podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad del producto. Los datos metabolómicos proporcionan una lectura de estas interacciones en un momento dado y son informativos del estado bioquímico de un organismo. Además, los metabolitos individuales o paneles de metabolitos se pueden utilizar como biomarcadores precisos para la predicción y gestión del rendimiento y la calidad. Se prevé que el metaboló vegetal contiene miles de moléculas pequeñas con propiedades fisicoquímicas variadas que proporcionan una oportunidad para una visión bioquímica de los rasgos fisiológicos y el descubrimiento de biomarcadores. Para explotar esto, un objetivo clave para los investigadores metabolómicos es capturar la mayor cantidad posible de diversidad fisicoquímica dentro de un solo análisis. Aquí presentamos un método metabolómico no dirigido basado en cromatografía líquida-espectrometría de masas para el análisis del grano de trigo cultivado en campo. El método utiliza el administrador de disolventes cuaternarios de cromatógrafo líquido para introducir una tercera fase móvil y combina un gradiente de fase invertida tradicional con un gradiente lipid-amenable. La preparación de granos, la extracción de metabolitos, el análisis instrumental y los flujos de trabajo de procesamiento de datos se describen en detalle. Se observó una buena precisión de masa y reproducibilidad de la señal, y el método produjo aproximadamente 500 características biológicamente relevantes por modo de ionización. Además, se determinaron señales significativamente diferentes de metabolitos y lípidos entre variedades de trigo.
Introduction
Comprender las interacciones entre los genes, el medio ambiente y las prácticas de gestión en la agricultura podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad de los productos. Los metabolitos vegetales están influenciados por factores como el genoma, el medio ambiente (clima, lluvias, etc.), y en un entorno agrícola, la forma en que se gestionan los cultivos (es decir, la aplicación de fertilizantes, fungicidas, etc.). A diferencia del genoma, el metabolóme está influenciado por todos estos factores y, por lo tanto, los datos metabolómicos proporcionan una huella bioquímica de estas interacciones en un momento determinado. Por lo general, hay uno de los dos objetivos para un estudio basado en metabolómica: en primer lugar, lograr una comprensión más profunda de la bioquímica del organismo y ayudar a explicar el mecanismo de respuesta a la perturbación (estrés abiótico o biótico) en relación con la fisiología; y en segundo lugar, asociar biomarcadores con la perturbación en estudio. En ambos casos, el resultado de tener este conocimiento es una estrategia de gestión más precisa para lograr el objetivo de mejorar el tamaño y la calidad del rendimiento.
Se prevé que el metaboló de la planta contenga milesde 1 de moléculas pequeñas con propiedades fisicoquímicas variadas. Actualmente, ninguna plataforma metabolómica (predominantemente espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear) puede capturar todo el metabolóme en un solo análisis. El desarrollo de estas técnicas (preparación de muestras, extracción y análisis de metabolitos), que proporcionan una cobertura lo más grande posible del metaboló metandolo en una sola ejecución analítica, es un objetivo clave para los investigadores metabolómicos. Los análisis metabolómicos no focalizados anteriores del grano de trigo han combinado datos de múltiples separaciones cromatográficas y polaridades de adquisición y/o instrumentación para una mayor cobertura de metabolóme. Sin embargo, esto ha requerido que las muestras se preparen y adquieran por separado para cada modalidad. Por ejemplo, Beleggia et al.2 prepararon una muestra derivada para el análisis GC-MS de analitos polares, además del análisis GC-MS de los analitos no polares. 3 utilizaron métodos GC y LC-MS para mejorar la cobertura en sus análisis; sin embargo, este enfoque generalmente requeriría preparaciones de muestras separadas como se describió anteriormente, así como dos plataformas analíticas independientes. Los análisis previos de grano de trigo utilizando GC-MS2,3,4 y LC-MS3,5 plataformas han producido 50 a 412 (55 identificados) características para GC-MS, 409 para GC-MS combinado y LC-MS y varios miles para un análisis de lipidómica LC-MS5. Mediante la combinación de al menos dos modos en un solo análisis, se puede mantener una cobertura de metabolóme ampliada, aumentando la riqueza de la interpretación biológica y al mismo tiempo ofreciendo ahorros en tiempo y costo.
Para permitir la separación eficiente de una amplia gama de especies de lípidos mediante cromatografía en fase inversa, las metodologías de lipidomics modernas suelen utilizar una alta proporción de isopropanol en el disolvente de elución6,proporcionando amenabilidad a las clases de lípidos que de otro modo podrían no ser resueltos por la cromatografía. Para una separación eficiente de lípidos, la fase móvil inicial también es mucho mayor en la composición orgánica7 que los métodos cromatográficos de fase invertida típicos, que consideran otras clases de moléculas. La alta composición orgánica al comienzo del gradiente hace que estos métodos sean menos adecuados para muchas otras clases de moléculas. Más notablemente, la cromatografía líquida de fase invertida emplea un gradiente de disolvente binario, comenzando con una composición mayormente acuosa y aumentando en contenido orgánico a medida que aumenta la resistencia a la elución de la cromatografía. Con este fin, buscamos combinar los dos enfoques para lograr la separación de las clases de lípidos y no lipídicos de metabolitos en un solo análisis.
Aquí, presentamos un método cromatográfico que utiliza una tercera fase móvil y permite una fase invertida tradicional combinada y un método de cromatografía apropiado para lipidómica utilizando una sola preparación de muestra y una columna analítica. Hemos adoptado muchas de las medidas de control de calidad y pasos de filtrado de datos que se han implementado previamente en estudios metabolómicos predominantemente clínicos. Estos enfoques son útiles para determinar características sólidas con alta reproducibilidad técnica y relevancia biológica y excluyen aquellas que no cumplen estos criterios. Por ejemplo, describimos el análisis de repetición de la muestra de control de calidad agrupada8, corrección de QC9, filtrado de datos9,10 e imputación de las características faltantes11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un método metabolómico no dirigido basado en LC-MS para el análisis del grano de trigo. El método combina cuatro modos de adquisición (fase invertida y fase invertida lipida-amenable con ionización positiva y negativa) en dos modos mediante la introducción de una tercera fase móvil en el gradiente de fase invertido. El enfoque combinado produjo aproximadamente 500 características biológicamente relevantes por polaridad iónca, con aproximadamente la mitad de ellas significativamente diferente…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el programa de Becas de Agricultura y Alimentos del Primer Ministro de Australia Occidental (Departamento de Empleo, Turismo, Ciencia e Innovación, Gobierno de Australia Occidental) y el Profesor Simon Cook (Centro de Agricultura Digital, Universidad de Curtin y Universidad de Murdoch). Los ensayos de campo y la recolección de muestras de granos fueron apoyados por el gobierno del programa de Regalías para Regiones de Australia Occidental. Reconocemos a Grantley Stainer y Robert French por sus contribuciones a los ensayos de campo. Bioplatforms Australia, financiada por NCRIS, es reconocida por la financiación de equipos.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referencias
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