밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석
Summary
밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.
Abstract
유전자, 환경 및 농업 관행의 관리 사이의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리 할 수 있습니다. Metabolomics 데이터는 주어진 순간에 이 상호 작용의 판독을 제공하고 유기체의 생화확적인 상태의 유익합니다. 또한, 개별 대사 산물 또는 대사 산물의 패널은 수율 및 품질 예측 및 관리를위한 정확한 바이오 마커로 사용될 수있다. 식물 메타볼로메는 생리적 특성과 바이오마커 발견에 대한 생화학적 통찰력을 제공하는 다양한 물리화학적 특성을 가진 수천 개의 소분자를 함유할 것으로 예측됩니다. 이를 악용하기 위해, 대사체학 연구원의 주요 목표는 단일 분석 내에서 가능한 한 많은 물리 화학적 다양성을 포착하는 것입니다. 여기에서 우리는 필드 성장한 밀 곡물의 분석을 위한 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기지를 둔 표적으로 한 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 액체 크로마토그래피 사분면 용매 관리자를 사용하여 제 3 의 이상을 소개하고 전통적인 역상 그라데이션과 지질 -amenable 그라데이션을 결합합니다. 곡물 준비, 대사 산물 추출, 도구 분석 및 데이터 처리 워크플로우에 대해 자세히 설명합니다. 양호한 질량 정확도 및 신호 재현성이 관찰되었고, 이 방법은 이온화 모드당 약 500개의 생물학적으로 관련된 특징을 산출하였다. 또한, 밀 품종 간의 현저하게 다른 대사 산물 및 지질 특징 신호를 결정했습니다.
Introduction
농업의 유전자, 환경 및 관리 관행 간의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 식물 대사 산물은 게놈, 환경 (기후, 강우 등)과 같은 요인에 의해 영향을 받고 농업 환경에서 작물을 관리하는 방식 (즉, 비료, 살균제 등의 적용)에 의해 영향을받습니다. 게놈과는 달리, 대사체는 이 요인 전부에 의해 영향을 받고 그러므로 metabolomics 데이터는 특정 시간에 이 상호 작용의 생화확적인 지문을 제공합니다. 일반적으로 대사체학 기반 연구에 대한 두 가지 목표 중 하나가 있습니다: 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 섭동 (생체 또는 생체 스트레스)에 대한 반응 메커니즘을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 섭동과 연관시다. 두 경우 모두 이러한 지식을 보유한 결과는 수율 크기와 품질 향상이라는 목표를 달성하기 위한 보다 정확한 관리 전략입니다.
식물 메타볼로메는 다양한 물리 화학적 특성을 가진 수천개의 작은 분자를 포함할 것으로 예측됩니다. 현재, 어떤 대사체학 플랫폼 (주로 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법)은 단 하나 분석에서 전체 metabolome를 붙잡을 수 없습니다. 이러한 기술 개발 (샘플 준비, 대사 산물 추출 및 분석), 단일 분석 실행 내에서 가능한 한 대사 체의 큰 범위를 제공, 대사 체학 연구원에 대 한 주요 목표. 밀 곡물의 이전 비표적 대사체학 분석은 더 큰 대사체 범위를 위해 다중 크로마토그래피 분리 및 획득 극성 및/또는 계측에서 얻은 데이터를 결합했습니다. 그러나, 이것은 각 양식에 대해 별도로 준비하고 취득하는 견본을 요구했습니다. 예를 들어, Beleggia등 2는 비극성 분석물의 GC-MS 분석 이외에 극성 분석물의 GC-MS 분석을 위한 유도체 샘플을 제조하였다. Das etal.3은 GC- 및 LC-MS 방법을 모두 사용하여 분석에서 커버리지를 개선했습니다. 그러나, 이 접근법은 일반적으로 위에서 설명한 바와 같이 별도의 샘플 준비뿐만 아니라 두 개의 독립적인 분석 플랫폼이 필요합니다. GC-MS2,3,3,4 및 LC-MS33,5 플랫폼을 이용한 밀곡물의 이전 분석은 GC-MS에 대한 50 내지 412(55identified) 특징을 산출하였고, 409는 GC-MS 및 LC-MS를 결합하고 LC-MS 지질학 분석에 대해 수천 개의 특징을 산출하였다 5.5 단일 분석에 적어도 두 개의 모드를 결합하여 확장된 대사체 커버리지를 유지하여 생물학적 해석의 풍요로움을 높이는 동시에 시간과 비용을 모두 절감할 수 있습니다.
역상 크로마토그래피에 의해 광범위한 지질 종의 효율적인 분리를 허용하기 위해, 현대 지질학 방법론은 일반적으로 용출 용매6에서이소프로판올의 높은 비율을 사용하며, 그렇지 않으면 크로마토그래피에 의해 해결되지 않을 수 있는 지질 클래스에 대한 어플가능성을 제공한다. 효율적인 지질 분리를 위해, 시작 이동상은 또한 분자의 다른 클래스를 고려하는 전형적인 역상 크로마토그래피 방법보다 유기조성물 7에서 훨씬 더 높다. 그라데이션의 시작 부분에 높은 유기 조성물은 분자의 많은 다른 클래스에 이러한 방법을 덜 적합하게. 가장 주목할 만한, 역상 액체 크로마토그래피는 주로 수성 조성으로 시작하여 크로마토그래피의 용출 강도가 증가함에 따라 유기 함량이 증가하는 이진 용매 구배를 채용합니다. 이를 위해, 우리는 단일 분석 내에서 대사 산물의 지질 및 비 지질 클래스의 분리를 달성하기 위해 두 가지 접근법을 결합하고자했습니다.
여기에서는, 우리는 제 3 이상을 사용하고 단 하나 견본 준비 및 1개의 분석 컬럼을 사용하여 전통적인 반전상 및 lipidomics 적합한 크로마토그래피 방법을 결합하는 크로마토그래피 방법을 제시하는 것을 제시합니다. 당사는 주로 임상 대사체학 연구에서 이전에 구현된 많은 품질 관리 조치 및 데이터 필터링 단계를 채택했습니다. 이러한 접근법은 높은 기술적 재현성 및 생물학적 관련성을 가진 견고한 특징을 결정하는 데 유용하며 이러한 기준을 충족하지 않는 특징은 제외합니다. 예를 들어, 풀링된 QC 샘플8,QC 보정9,데이터 필터링9,,10 및 누락된 피처의대칭(11)의반복 분석을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 밀 곡물의 분석을 위한 LC-MS 기지를 둔 표적되지 않은 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 4개의 획득 모드(역단계 및 지질-반응성 역위상과 양성 및 음수 이온화)를 두 가지 모드로 결합하여 제3 의 이동상을 역위상 구배로 도입한다. 결합된 접근은 밀 품종 사이 강렬에 있는 이의 대략 반을 가진 이온 극성 당 대략 500의 생물학적으로 관련있는 특징을 산출했습니다. 다른 밀 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 서호주 프리미어의 농업 및 식품 펠로우십 프로그램 (일자리, 관광, 과학 및 혁신학과, 웨스턴 오스트레일리아 정부)과 프리미어 펠로우 인 사이먼 쿡 (센터 디지털 농업, 커튼 대학과 머독 대학). 현장 시험 및 곡물 샘플 수집은 서호주 의 지역 로열티 프로그램에 대한 정부의 지원을 받았습니다. 우리는 현장 시험에 기여한 그랜틀리 스테인러와 로버트 프랑스어를 인정합니다. NCRIS가 자금을 지원하는 바이오 플랫폼 오스트레일리아는 장비 자금 조달을 인정받고 있습니다.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
Referencias
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