Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode
Summary
Ziel ist es, bioaktive kleine Moleküle, Peptide aus einem komplexen Pflanzenextrakt und Proteine aus pathogenen Mikroben durch die Anwendung der Flüssigphasen-Isotonisierungsmethode (IEF) zu fraktionieren und zu isolieren. Darüber hinaus wurden die getrennten Moleküle identifiziert und ihre Bioaktivität bestätigt.
Abstract
Natürliche Produkte aus Pflanzen und Mikroben sind eine reiche Quelle bioaktiver Moleküle. Vor ihrer Verwendung müssen die aktiven Moleküle aus komplexen Extrakten für nachgeschaltete Anwendungen gereinigt werden. Es gibt verschiedene chromatographische Methoden für diesen Zweck zur Verfügung, aber nicht alle Labore können sich Hochleistungsmethoden leisten und die Isolierung von komplexen biologischen Proben kann schwierig sein. Hier zeigen wir, dass präparative flüssige Phasen-Isoelektrische Fokussierung (IEF) Moleküle, einschließlich kleiner Moleküle und Peptide, von komplexen Pflanzenextrakten trennen kann, basierend auf ihren isoelektrischen Punkten (pI). Wir haben die Methode zur komplexen biologischen Probenfraktionierung und Charakterisierung eingesetzt. Als Beweis des Konzepts, Wir fraktioniert einen Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt, Isolierung einer Familie von Terpenoid Saponin kleine Moleküle und ein Peptid. Wir haben auch eine effektive mikrobielle Proteintrennung mit dem Candida albicans Pilz als Modellsystem demonstriert.
Introduction
Die Reinigung von Biomolekülen aus komplexen biologischen Proben ist ein wesentlicher und oft schwieriger Schritt in biologischen Experimenten1. Isoelektrische Fokussierung (IEF) eignet sich gut für die hochauflösende Trennung komplexer Biomoleküle, bei denen Trägerampholyten nach ihrer Ladung reisen und den pH-Gradienten in einem elektrischen Feld3festlegen. Die erste kommerzielle Trägerampholyte für IEF wurde 1964 von Olof Vesterberg entwickelt und4,5patentiert. Trägerampholyte sind aliphatische Oligo-Amino-Oligo-Carbonsäuremoleküle unterschiedlicher Länge und Verzweigung6. Anschließend verbesserten Vesterberg und andere die Trägerampholyten für ihren erweiterten Einsatz bei der Trennung von Biomolekülen6,7.
Zu den Methoden zur Trennung von Biomolekülen gehören Agarose und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE), isoelektrische Fokussierung, Kapillarelektrophorese, Isotachophorese und andere chromatographische Techniken (z.B. TLC, FPLC, HPLC)2. Liquid-Phase IEF in einem Instrument namens “Rotofor” durchgeführt wurde von Milan Bier8erfunden. Er war Pionier des Konzepts und der Gestaltung dieses Instruments und trug maßgeblich zur Theorie der elektrophoretischen Migration bei. Sein Team entwickelte auch ein mathematisches Modell des elektrophoretischen Trennverfahrens für Computersimulationen9.
Das Flüssigphasen-IEF-Gerät ist eine horizontal rotierende zylindrische Zelle, die aus einem Nylonkern besteht, der in 20 poröse Fächer und einen zirkulierenden Wasserkühlkeramikstab unterteilt ist. Die porösen Kammern ermöglichen es Molekülen, durch die wässrige Phase zwischen den Elektroden zu wandern und die Sammlung von gereinigten Proben unter Vakuum in Fraktionen zu ermöglichen. Dieses Reinigungssystem kann bis zu 1000-fache Reinigung eines bestimmten Moleküls in <4 Stunden ermöglichen. Ein wertvolles Merkmal dieses Instruments ist, dass es als erster Schritt für die Reinigung aus einer komplexen Mischung oder als letzter Schritt zur Erreichung der Reinheit10angewendet werden kann. Wenn das Molekül von Interesse ein Protein ist, ist ein weiterer Vorteil, dass seine native Konformation während der Trennung erhalten bleibt.
Die Verwendung von Flüssigphase IEF wurde weithin für Proteine, Enzyme und Antikörper-Reinigung6,10,11,12,13,14berichtet. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Ansatzes zur Trennung und Reinigung kleiner Moleküle und Peptide von der Heilpflanze Gymnema sylvestre. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, aktive kleine Moleküle aus einem Pflanzenextrakt für nachgelagerte Anwendungen kostengünstig zu konzentrieren und zu reinigen. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass die Anreicherung von Proteinen aus einem komplexen Proteinextrakt aus Candida albicans Pilz15 in diesem IEF-basierten System als zweites Beispiel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kleine Moleküle aus natürlichen Produktquellen (z. B. Pflanzen) umfassen komplexe sekundäre Metaboliten, die in der chemischen Struktur sehr unterschiedlich sind. Es wird angenommen, dass sie an Pflanzenabwehrmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind Polypeptide auch in Pflanzengeweben22vorhanden. Diese natürlichen Produkt kleine Moleküle sind reiche Quellen von Testmolekülen für die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten. Die schwierigen und mühsamen Methoden, die für ihre Is…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Finanzierungsquellen der Division of Biology und des Johnson Cancer Research Center für BRIEF- und IRA-Auszeichnungen bzw. an GV. Wir danken auch dem K-INBRE Postdoktorandenpreis an RV. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20 GM103418 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of General Medical Sciences oder der National Institutes of Health dar. Wir danken den anonymen Rezensenten für ihre hilfreichen Kommentare.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
Referencias
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