生物活性小分子、天然源からのペプチド、微生物からのタンパク質の分離(IEF)法による分離
Summary
目的は、液相等電体集光(IEF)法を用いることによって、生理活性小分子、複雑な植物抽出物からのペプチド、および病原性微生物からのタンパク質を分画し、単離することです。さらに、分離した分子を同定し、その生物活性を確認した。
Abstract
植物や微生物由来の天然物は、生物活性分子の豊富な供給源です。使用する前に、複雑な抽出物からの活性分子を下流の適用のために精製しなければならない。この目的のために利用可能な様々なクロマトグラフィー方法がありますが、すべてのラボが高性能の方法を提供できるわけではないし、複雑な生物学的サンプルからの分離は困難な場合があります。ここでは、微分液体相等圧体集光(IEF)が、その等電点(pI)に基づいて、小分子やペプチドを含む分子を複雑な植物抽出物から分離できることを実証する。我々は、複雑な生物学的サンプル分画と特性評価にこの方法を用いた。概念実証として、我々は、小分子とペプチドのテルペノイドサポニンのファミリーを単離し、ジムネマシルヴェストル植物抽出物を分画した。また、カンディダ・アルビカンス菌をモデルとして用いた微生物タンパク質分離の効果も実証した。
Introduction
複雑な生体試料からの生体分子の精製は、生物学的実験において不可欠かつしばしば困難なステップである1。等電式焦点(IEF)は、担体アンホリュートが電荷に従って移動し、電場3にpH勾配を確立する複雑な生体分子の高解像度分離に適している。IEFのための最初の商業キャリアアンプホーリテは、1964年にオロフ・ヴェスターベルクによって開発され、特許を取得しました4,5.担体アンプリエステルは、脂肪族オリゴ-アミノオリゴ-カルボン酸分子の様々な長さと分岐6.その後、ベスターバーグらは生体分子,6,7を分離する際の使用拡大のためにキャリアアンプリ6ケートを改良した。
生体分子を分離する方法としては、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動(2-DE)、等電集、キャピラリー電気泳動、イソタコフォレシス、その他のクロマトグラフィー技術(例えば、TLC、FPLC、HPLC)2が挙げられる。2「ロトフォー」と呼ばれる器械で行われた液体相IEFは、ミラノ・ビア8によって発明された。彼は、この装置のコンセプトとデザインを開拓し、電気泳動の理論に広く貢献しました。彼のチームはまた、コンピュータシミュレーションのための電気泳動分離プロセスの数学的モデルを開発しました 9.
液相IEF装置は、20の多孔質コンパートメントと循環水冷却セラミックロッドに分割されたナイロンコアからなる水平回転円筒形セルである。多孔質チャンバーは、分子が電極間の水相を通って移動することを可能にし、分画の真空下で精製されたサンプルの収集を可能にする。この精製システムは、特定の分子を<4時間で最大1000倍に精製することができます。この装置の貴重な特徴は、複雑な混合物から精製するための第一歩として、または純度10を達成するための最終ステップとして適用することができるということです。目的の分子がタンパク質である場合、別の利点は、その天然の立体構造が分離中に維持されることである。
液体相IEFの使用は、タンパク質、酵素および抗体,,精製66、10、11、12、13、1410,11について広く報告されている。13,1412ここでは、このアプローチを用いて、小分子とペプチドを薬用植物Gymnema sylvestreから分離および精製する方法について説明します。このプロトコルは、研究者が低コストで下流のアプリケーションのための植物抽出物から活性小分子を濃縮し、精製するのに役立ちます。また、このIEF系系ではカンジダ・アルビカンス菌15から抽出した複雑なタンパク質抽出物からのタンパク質の濃縮が2番目の例として示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
天然物源(植物など)からの小分子は、化学構造において非常に多様な複雑な二次代謝産物を含む。彼らは植物の防衛メカニズムに関与していると考えられています。また、ポリペプチドは植物組織22にも存在する。これらの天然物の小分子は、創薬と開発のための試験分子の豊富な供給源です。しかし、その分離と精製に必要な困難で退屈な方法は、治療用途への使用を制限…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、生物学部門とジョンソンがん研究センターのBRIEFおよびIRA賞の資金源に感謝しています。また、RVに対するK-INBREポスドク賞に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の機関開発賞(IDeA)によって、助成金番号P20 GM103418の下で部分的に支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立一般医学研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。私たちは、彼らの役に立つコメントのために匿名のレビュー担当者に感謝します。
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
Referencias
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