Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار
Summary
هذه الورقة تفيد بأن إضافة Y-27632 إلى تيفا المتوسطة يمكن أن تزيد بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية من أنسجة الجلد الكبار.
Abstract
إن عزل وثقافة الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد مهمة جداً للبحوث البيولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع للتطبيقات السريرية. عزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد عن طريق الطريقة التقليدية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع لتمرير ما يكفي. والأهم من ذلك، فإن الأنسجة المستخدمة عادة ما تكون من قبل الوليد، ولا يزال يشكل تحدياً لعزل الخلايا الصباغية الأولية بكفاءة عن الأنسجة البالغة. لقد طورنا مؤخرًا طريقة عزل جديدة للميلانوسيات تضيف Y-27632، وهو مثبط Rho kinase، إلى متوسط الثقافة الأولي لمدة 48 ساعة. نحن الآن وصف هذه الطريقة الجديدة بمزيد من التفصيل باستخدام البشرة الكبار لثقافة بكفاءة الخلايا الصباغية الأولية. الأهم من ذلك، ونحن نظهر أن الخلايا الصباغية التي تم الحصول عليها من أنسجة البالغين التي أعدتها هذه الطريقة الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي. هذا البروتوكول الجديد سوف تستفيد بشكل كبير دراسات عيوب التصبغ والميلانوما باستخدام الخلايا الميلانوسية الأولية التي أعدت من أنسجة الجلد الكبار الوصول إليها بسهولة.
Introduction
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الصباغية عن البشرة من الجلد للبالغين للأبحاث البيولوجية والتطبيقات السريرية. الصباغيات، التي تقع في البشرة القاعدية من الجلد وفي بصيلات الشعر، تلعب دورا هاما في تصبغ الجلد والشعر من خلال إنتاج الميلانين1. إن تصبغ الجلد الناتج من الخلايا الصباغية الجلدية يعمل كمصفاة للأشعة فوق البنفسجية التي تقلل / تمنع تلف الحمض النووي للخلايا الكامنة في الجلد2. انتشار غير طبيعي من الخلايا الصباغية في الجلد أمر شائع جدا، كما هو الحال في تشكيل نيفي حميدة (الشامات) التي الخلايا الصباغية يحتمل أن تتحول إلى نمو oncogenic تليها الشيخوخة الخلوية3.
منذ عام 1957، كانت العزلة والثقافة اللاحقة للميلانوسيات الأولية البشرية ممكنة4، ولكن فقط منذ عام 1982 كان هناك طريقة فعالة يمكن أن تنشئ ثقافات الخلايا الميلانوسية البشرية من البشرة5. الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الصباغية الأولية من البشرة ينطوي على هضم الأنزيمية على خطوتين. باختصار ، يتم هضم الجلد في البداية مع عدم السيك مع فصل البشرة عن الأدمة ، وبعد ذلك يتم هضم البشرة مع التربسين لإنتاج تعليق يحتوي على الخلايا الصباغية والكيرتينوسيات ، والتي يمكن بعد ذلك أن تزرع بشكل انتقائي في وسائل الإعلام المختلفة. حاليا، والثقافة الأولية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع للميلانوسيات للوصول إلى التقاء باستخدام الطريقة التقليدية، والتي من المرجح أن يرجع ذلك إلى انخفاض كفاءة عزلتهم. لذلك، فإن زيادة الإنتاج الأولي للميلانوسيات من أنسجة الجلد البالغة تكون مفيدة جداً لكل من البحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.
العديد من عوامل النمو, وقد ثبت أن معظمها تفرز بواسطة keratinocytes (على سبيل المثال, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF و SCF)5-8–8, تنظيم تمايز وانتشار الميلانوسيات الثدييات. في غياب طبقات التغذية، وعدم وجود تلك العوامل النمو يؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الصباغية وزيادة المبرمج9. يمكن أن تؤدي الثقافة المشتركة للكيراتينوسيات كخلايا مغذيات والخلايا الصباغية إلى انتشار الصباغي المتسارع وتقليل المبرمج. ومع ذلك، فإن طريقة الثقافة المشتركة لا تتطلب فقط المزيد من أنسجة الجلد لإعداد الكيراتينوسيات، وهو أمر غير عملي، ولكن أيضا لا يمكن أن تعمل بكفاءة لأن ظروف الثقافة المطلوبة من قبل الخلايا الصباغية لا تفضل نمو الكيراتينوسيت، والعكس بالعكس.
وقد ذكرت الدراسات السابقة أن إضافة Y-27632، وهو المانع روك، في وسط النمو يمكن أن تعزز من العائد من خلايا البشرة الأولية البشرية من أنسجة الجلد10-14–14. ولذلك، سيكون من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان عزل الخلايا الصباغية الأولية البشرية سوف تستفيد من وجود Y-27632. في الواقع، إضافة Y-27632 في التفا المتوسطة15، الذي يحتوي على TPA، IBMX،نا 3VO4 و dbcAMP، زادت بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية الأولية المعزولة من أنسجة الدبلين في الثقافات الأولية16. بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا البروتوكول الجديد هو أكثر كفاءة في زيادة العائد من الخلايا الصباغية16. لذلك، يصف هذا البروتوكول الطريقة الجديدة بالتفصيل باستخدام أنسجة الجلد للبالغين على أساس دراسة سابقة16 من أجل تعزيز تطبيقها في البحوث البيولوجية الأساسية والتطبيقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
واستند البروتوكول الموصوف هنا إلى منشور صدر مؤخراً16. وينبغي إيلاء بعض الاهتمام للخطوات الحاسمة التالية لتحقيق أفضل النتائج باستخدام الأسلوب الجديد. أولاً، الفصل الناجح بين البشرة والأدمة أمر بالغ الأهمية. قطع أنسجة قلفة الكبار إلى شرائط واسعة 3-4 مم باستخدام شفرة مشرط لجعل ا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0104604)، والبرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772093)، ومشروع البحوث اللوجستية العسكرية (AWS17J005)، والبرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) ) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى مؤسسة X.W. Guangdong الأساسية والتطبيقية للأبحاث الأساسية (2019A151510833) وصناديق البحوث الأساسية لجامعة شاندونغ (2019GN043) إلى J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Referencias
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
