Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben
Summary
Dieses Papier berichtet, dass die Zugabe von Y-27632 zu TIVA Medium kann die Ausbeute von Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe deutlich erhöhen.
Abstract
Die Isolierung und Kultur von primären Melanozyten aus Hautgeweben ist sehr wichtig für die biologische Forschung und wurde häufig für klinische Anwendungen verwendet. Die Isolierung von primären Melanozyten aus Hautgewebe nach der herkömmlichen Methode dauert in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen, um ausreichend zu durchgehen. Noch wichtiger ist, dass die verwendeten Gewebe in der Regel neugeborene Vorhaut sind und es ist immer noch eine Herausforderung, primäre Melanozyten effizient aus erwachsenen Geweben zu isolieren. Wir haben vor kurzem eine neue Isolationsmethode für Melanozyten entwickelt, die Y-27632, einen Rho-Kinase-Inhibitor, zum ursprünglichen Kulturmedium für 48 h hinzufügt. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll erhöht diese neue Methode dramatisch die Ausbeute von Melanozyten und verkürzt die Zeit, die erforderlich ist, um Melanozyten aus Vorhautgeweben zu isolieren. Wir beschreiben diese neue Methode nun ausführlicher mit Erwachsenenepidermis, um primäre Melanozyten effizient zu kulturieren. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass Melanozyten aus erwachsenen Geweben, die mit dieser neuen Methode hergestellt werden, normal funktionieren können. Dieses neue Protokoll wird Studien zu Pigmentdefekten und Melanomen mit primären Melanozyten, die aus leicht zugänglichen erwachsenen Hautgeweben hergestellt werden, erheblich zugute kommen.
Introduction
Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung von Melanozyten aus der Epidermis der erwachsenen Haut für biologische Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Melanozyten, die sich in der Basalepidermis der Haut und in Haarfollikel befinden, spielen eine wichtige Rolle bei der Pigmentierung von Haut und Haaren durch die Produktion von Melanin1. Die daraus resultierende Hautpigmentierung aus epidermalen Melanozyten wirkt als ultravioletter Strahlungsfilter, der DNA-Schäden an darunter liegenden Zellen in der Haut reduziert/verhindert2. Die abnorme Proliferation von Melanozyten in der Haut ist durchaus üblich, wie bei der Bildung von gutartigen Nevi (Molen), bei denen Melanozyten potenziell zu onkogenem Wachstum transformieren können, gefolgt von zellulärer Seneszenz3.
Seit 1957 ist die Isolation und nachfolgende Kultur menschlicher Primärmelanozyten möglich4, aber erst seit 1982 gibt es eine effiziente Methode, die Reproduzierbar Kulturen menschlicher Melanozyten aus der Epidermisetablierenkann 5 . Die herkömmliche Methode, primäre Melanozyten von der Epidermis zu isolieren, beinhaltet eine zweistufige enzymatische Verdauung. Kurz gesagt, die Haut wird zunächst mit Dispase verdaut, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, danach wird die Epidermis mit Trypsin verdaut, um Suspensionen zu produzieren, die Melanozyten und Keratinozyten enthalten, die dann selektiv in verschiedenen Medien angebaut werden können. Derzeit dauert die Anfangskultur in der Regel etwa 3 bis 4 Wochen für Melanozyten, um die Konfluenz mit der herkömmlichen Methode zu erreichen, die wahrscheinlich auf die geringe Effizienz ihrer Isolierung zurückzuführen ist. Daher wäre die Erhöhung der erstmaligen Produktion von Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben sowohl für die Laborforschung als auch für klinische Anwendungen sehr hilfreich.
Viele Wachstumsfaktoren, von denen die meisten nachweislich durch Keratinozyten abgesondert werden (z.B. S-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF und SCF)5–8, regulieren die Differenzierung und Proliferation von Säugetiermelanozyten. In Ermangelung von Feederschichten führt das Fehlen dieser Wachstumsfaktoren zu einer verminderten Proliferation von Melanozyten und ihrer erhöhten Apoptose9. Die Kokultur der Keratinozyten als Feederzellen und Melanozyten könnte zu einer beschleunigten Melanozytenproliferation und reduzierter Apoptose führen. Die Co-Kultur-Methode verlangt jedoch nicht nur mehr Hautgewebe, um Keratinozyten zuzubereiten, was nicht praktikabel ist, sondern konnte auch nicht effizient arbeiten, weil die von Melanozyten geforderten Kulturbedingungen das Keratinozytenwachstum nicht begünstigen und umgekehrt.
Frühere Studien haben berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem ROCK-Hemmer, in das Wachstumsmedium die Ausbeute menschlicher primärer epidermaler Zellen aus Hautgeweben10–14verbessern kann. Daher wäre es interessant zu testen, ob die Isolierung menschlicher Primärmelanozyten von der Anwesenheit von Y-27632 profitieren würde. Tatsächlich erhöhte die Zugabe von Y-27632 in das Inokulations-TIVA-Medium15, das TPA, IBMX, Na3VO4 und dbcAMP enthält, die Ausbeute von primären Melanozyten, die aus Vorhautgeweben in den Ausgangskulturen isoliert sind, signifikant16. Im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll ist dieses neue Protokoll deutlich effizienter bei der Erhöhung der Ausbeute an Melanozyten16. Daher beschreibt dieses Protokoll die neue Methode im Detail unter Verwendung von erwachsenen Hautgeweben auf der Grundlage einer früheren Studie16, um ihre Anwendung in der Grundlagen- und angewandten biologischen Forschung zu fördern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll basiert auf einer kürzlichveröffentlichten 16. Den folgenden kritischen Schritten sollte einige Aufmerksamkeit geschenkt werden, um mit der neuen Methode die besten Ergebnisse zu erzielen. Erstens ist eine erfolgreiche Trennung der Epidermis und der Dermis entscheidend. Schneiden Sie das erwachsene Vorhautgewebe mit einer Skalpellklinge in 3-4 mm breite Streifen, damit die Dispase gründlicher und einfacher wirken, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Zweit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 6) und das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shandong (2019GSF108107) an die X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) und die Fundamental Research Funds der Shandong University (2019GN043) an J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Referencias
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