Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta
Summary
Questo documento riporta che l’aggiunta di Y-27632 al mezzo TIVA può aumentare significativamente la resa dei melanociti dai tessuti della pelle adulti.
Abstract
L’isolamento e la coltura dei melanociti primari dai tessuti della pelle è molto importante per la ricerca biologica ed è stato ampiamente utilizzato per applicazioni cliniche. Isolare i melanociti primari dai tessuti della pelle con il metodo convenzionale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per passare sufficientemente. Ancora più importante, i tessuti utilizzati sono di solito pregeniti ed è ancora una sfida per isolare in modo efficiente i melanociti primari dai tessuti adulti. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo di isolamento per i melanociti che aggiunge Y-27632, un inibitore della chinasi del Rho, al mezzo di coltura iniziale per 48 h. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo metodo aumenta drasticamente la resa dei melanociti e riduce il tempo necessario per isolare i melanociti dai tessuti di prepuzio. Ora descriviamo questo nuovo metodo in modo più dettagliato usando l’epidermide adulta per coltivare in modo efficiente i melanociti primari. È importante sottolineare che i melanociti ottenuti da tessuti adulti preparati da questo nuovo metodo possono funzionare normalmente. Questo nuovo protocollo beneficerà in modo significativo gli studi di difetti di pigmentazione e melanomi utilizzando melanociti primari preparati da tessuti della pelle adulta facilmente accessibili.
Introduction
L’obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i melanociti dall’epidermide della pelle adulta per la ricerca biologica e le applicazioni cliniche. I melanociti, che si trovano nell’epidermide basale della pelle e nei follicoli piliferi, svolgono un ruolo importante nella pigmentazione della pelle e dei capelli producendo melanina1. La pigmentazione cutanea risultante dai melanociti epidermici agisce come un filtro di radiazione ultravioletta che riduce/previene il danno del DNA alle cellule sottostanti nella pelle2. La proliferazione anormale dei melanociti nella pelle è abbastanza comune, come nella formazione di nevi (talpe) benigni in cui i melanociti potenzialmente si trasformano in crescita oncogenica seguita dalla senescenza cellulare3 .
Dal 1957, l’isolamento e la successiva cultura dei melanociti primari umani è stato possibile4, ma solo dal 1982 c’è stato un metodo efficiente che può riprodurre in modo riproducibile le culture dei melanociti umani dall’epidermide5. Il metodo convenzionale per isolare i melanociti primari dall’epidermide comporta una digestione enzimatica in due fasi. In breve, la pelle viene inizialmente digerita con dispasi per separare l’epidermide dal derma, dopo di che l’epidermide viene digerita con la trypsin per produrre sospensioni contenenti melanociti e cheratinociti, che possono quindi essere coltivati selettivamente in diversi supporti. Attualmente, la cultura iniziale di solito richiede circa 3 o 4 settimane per i melanociti per raggiungere la confluenza utilizzando il metodo convenzionale, che è probabilmente dovuto alla bassa efficienza del loro isolamento. Pertanto, aumentare la produzione iniziale di melanociti dai tessuti della pelle adulti sarebbe molto utile sia per la ricerca di laboratorio che per le applicazioni cliniche.
Molti fattori di crescita, la maggior parte dei quali hanno dimostrato di essere secreti da cheratinociti (ad esempio, z-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)5–8, regolano la differenziazione e la proliferazione dei melanociti dei mammiferi. In assenza di strati di alimentatore, la mancanza di questi fattori di crescita porta alla diminuzione della proliferazione dei melanociti e alla loro aumento dell’apoptosi9. La co-coltura dei cheratinociti come cellule nutritrici e melanociti potrebbe portare ad accelerare la proliferazione del melanocito e a ridurre l’apoptosi. Tuttavia, il metodo di co-cultura non solo richiede più tessuti della pelle per preparare i cheratinociti, che non è pratico, ma potrebbe anche non funzionare in modo efficiente perché le condizioni di coltura richieste dai melanociti non favoriscono la crescita dei cheratinociti e viceversa.
Studi precedenti hanno riferito che l’aggiunta di Y-27632, un inibitore rock, nel mezzo di crescita può migliorare la resa delle cellule epidermiche primarie umane dai tessuti della pelle10–14. Pertanto, sarebbe interessante verificare se l’isolamento dei melanociti primari umani trarrebbe beneficio dalla presenza di Y-27632. Infatti, l’aggiunta di Y-27632 nell’inoculazione TIVA medium15, che contiene TPA, IBMX, Na3VO4 e dbcAMP, ha aumentato significativamente la resa dei melanociti primari isolati dai tessuti del prepuzio16. Rispetto al protocollo convenzionale, questo nuovo protocollo è significativamente più efficiente nell’aumentare la resa dei melanociti16. Pertanto, questo protocollo descrive in dettaglio il nuovo metodo utilizzando tessuti per la pelle adulti basati su uno studio precedente16 al fine di promuovere la sua applicazione nella ricerca biologica di base e applicata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto si basava su una recente pubblicazione16. Occorre prestare attenzione ai seguenti passi critici per ottenere i migliori risultati con il nuovo metodo. In primo luogo, una separazione di successo dell’epidermide e del dermide è fondamentale. Tagliare i tessuti adulti di prepuzio in strisce larghe 3-4 mm utilizzando una lama del bisturi per rendere il dispase lavorare più a fondo e facilmente per separare l’epidermide dal derma. In secondo luogo, quando si separano ques…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), il programma chiave della Shandong Provincia Natural Science Foundation e il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2019GSF108107) a X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A151510833) e I fondi di ricerca fondamentali della Shandong University (2019GN043) a J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Referencias
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