نقدم هنا طريقة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات بكفاءة ، دون الحاجة إلى نقل الجينات أو ناقلات الفيروسات القهقرية. وبالتالي ، فإن هذه الاستراتيجية واعدة للطب الانتقالي وتمثل تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية الجذعية.
يمكن عكس النمط الظاهري للخلية أو تعديله بطرق مختلفة ، مع مزايا وقيود خاصة بكل تقنية. هنا نصف استراتيجية جديدة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. هناك خطوتان رئيسيتان مطلوبتان. في الخطوة الأولى ، تتعرض الخلايا البالغة الناضجة (المتمايزة نهائيا) للممحاة اللاجينية 5-aza-cytidine لدفعها إلى حالة متعددة القدرات. تم تطوير هذا الجزء من البروتوكول ، استنادا إلى الفهم المتزايد للآليات اللاجينية التي تتحكم في مصير الخلية والتمايز ، ويتضمن استخدام المعدل اللاجيني لمحو الحالة المتمايزة للخلية ثم القيادة إلى نافذة عابرة عالية اللدونة.
في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا المحذوفة في مفاعلات حيوية دقيقة متعددة التترافلورو إيثيلين (PTFE) ، والمعروفة أيضا باسم الرخام السائل ، لتعزيز إعادة ترتيب الخلايا 3D لتوسيع والحفاظ على اللدونة العالية المكتسبة والحفاظ عليها بشكل ثابت. PTFE هو مركب اصطناعي غير تفاعلي مسعور ويسمح استخدامه بإنشاء بيئة دقيقة خلوية ، والتي لا يمكن تحقيقها في أنظمة الثقافة التقليدية 2D. يشجع هذا النظام ويعزز الحفاظ على تعدد القدرات من خلال الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي الحيوي.
الإجراءات التقنية الموضحة هنا هي استراتيجيات بسيطة للسماح بتحريض وصيانة حالة عالية اللدونة في الخلايا الجسدية البالغة. سمح البروتوكول باشتقاق خلايا عالية اللدونة في جميع أنواع الثدييات التي تم اختبارها. وبما أنه لا ينطوي على استخدام نقل الجينات وخال من النواقل الفيروسية، فقد يمثل تقدما تكنولوجيا ملحوظا لتطبيقات الطب الانتقالي. علاوة على ذلك ، يوفر نظام المفاعل الحيوي الدقيق تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية للخلايا الجذعية من خلال إعادة إنشاء بيئة دقيقة محددة في المختبر تسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا عالية اللدونة ، أي مثل ESCs و iPSCs والخلايا التي تم محوها فوق جيني و MSCs.
خلال العقود الماضية ، تم تنقيح المفهوم المقبول على نطاق واسع للتقدم أحادي الاتجاه نحو التزام الخلايا والتمايز بالكامل. وقد ثبت أنه يمكن عكس مواصفات الخلية ، ويمكن دفع خلية متمايزة نهائيا نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا ، باستخدام طرق مختلفة.
من بين الطرق العديدة المقترحة ، تتضمن إحدى الطرق الواعدة استخدام المركبات الكيميائية لحث الخلايا على ما يسمى بتعدد القدرات المستحث كيميائيا. الجزيئات الصغيرة المستخدمة في هذا النهج قادرة على التفاعل وتعديل التوقيع اللاجيني لخلية ناضجة بالغة ، وتجنب الحاجة إلى أي ناقل معدل وراثيا و / أو فيروسي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . أظهرت العديد من الدراسات مؤخرا أنه من الممكن تحويل الخلايا من نمط ظاهري إلى آخر من خلال توفير محفزات كيميائية حيوية وبيولوجية محددة تحفز على إعادة تنشيط الجينات مفرطة الميثيل 11،12،13،14،15. تسمح أحداث إزالة الميثيل هذه بتحويل الخلايا المتمايزة نهائيا إلى سلف بدائي أو خلية متعددة القدرات أو عالية اللدونة / متعددة القدرات 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
في موازاة ذلك ، ركزت العديد من الدراسات مؤخرا على فهم الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، وبشكل أكثر تحديدا ، على إمكانية استخدام القوى الميكانيكية للتأثير بشكل مباشر على مرونة الخلايا و / أو التمايز16،17،18،19. في الواقع ، لقد ثبت بوضوح أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا رئيسيا في التحكم في مصير الخلية. على وجه الخصوص ، فإن الإشارات الميكانيكية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تنتجها ECM تنظم مباشرة الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات ، مما يؤثر على سلوك الخلية ووظائفها20,21. وقد مهدت هذه البيانات الحديثة الطريق لتطوير أنظمة جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أوثق البيئة الدقيقة للخلايا في الجسم الحي ، وتكرر المحفزات الميكانيكية والفيزيائية التي تقود سلوك الخلية.
نحن هنا نصف بروتوكولا من خطوتين يجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. في الخطوة الأولى ، يتم احتضان الخلايا بجزيء إزالة الميثيل 5-aza-cytidine (5-aza-CR). هذا العامل قادر على الحث على إزالة ميثيل الحمض النووي العالمية الهامة من خلال التأثير المشترك للنقل المباشر من عشرة إلى أحد عشر (TET2) بوساطةالإجراء 8,10 والتثبيط غير المباشر لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT)22,23. تحفز هذه الخطوة على إزالة الكتل اللاجينية مع إعادة تنشيط لاحقة للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، وبالتالي توليد خلايا عالية اللدونة1،2،3،8،10 ، يشار إليها فيما يلي باسم “الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا”. في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا في نظام ثقافة 3D. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم استخدام المركب الاصطناعي غير التفاعلي الكارهة للماء polytetrafluoroethylene (PTFE ؛ مع حجم الجسيمات 1 ميكرومتر) كمفاعل حيوي دقيق ، والذي يسمح بإنشاء بيئة دقيقة خلوية لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد التقليدية10. تلتصق جزيئات مسحوق PTFE بسطح قطرة السائل التي يتم فيها إعادة تعليق الخلايا وتعزل قلب السائل عن السطح الداعم ، مع السماح بتبادل الغاز بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة24. يشجع “المفاعل الحيوي الدقيق PTFE” الذي تم الحصول عليه ، والمعروف أيضا باسم “الرخام السائل” ، الخلايا على التفاعل بحرية مع بعضها البعض ، مما يعزز إعادة ترتيب الخلايا ثلاثية الأبعاد25،26،27 ، ويمتد ويحافظ بثبات على حالة اللدونة العالية المكتسبة من خلال الإشارات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية10.
خلال العقود الماضية ، ركزت العديد من الدراسات على تطوير استراتيجيات لإعادة خلية متمايزة بشكل نهائي نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد الخلايا متعددة القدرات وصيانتها على المدى الطويل بدءا من الخلايا البالغة الناضجة المتمايزة نهائيا. تجمع هذه الطريقة ب…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كاراريسي و MiND FoodS Hub ID: 1176436. جميع المؤلفين هم أعضاء في COST Action CA16119 في المختبر 3-D إجمالي توجيه الخلايا واللياقة البدنية (CellFit).
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |