Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero
Summary
Presentiamo qui un metodo che combina l’uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.
Abstract
Il fenotipo cellulare può essere invertito o modificato con metodi diversi, con vantaggi e limitazioni specifici per ogni tecnica. Qui descriviamo una nuova strategia che combina l’uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Sono necessari due passaggi principali. Nella prima fase, le cellule adulte mature (differenziate terminalmente) sono esposte alla gomma epigenetica 5-aza-citidina per guidarle in uno stato pluripotente. Questa parte del protocollo è stata sviluppata, basata sulla crescente comprensione dei meccanismi epigenetici che controllano il destino e la differenziazione cellulare, e prevede l’uso del modificatore epigenetico per cancellare lo stato differenziato cellulare e quindi guidare in una finestra transitoria ad alta plasticità.
Nella seconda fase, le cellule cancellate sono incapsulate in micro-bioreattori di politetrafluoroetilene (PTFE), noti anche come marmi liquidi, per promuovere il riarrangiamento cellulare 3D per estendere e mantenere stabilmente l’elevata plasticità acquisita. Il PTFE è un composto sintetico idrofobico non reattivo e il suo utilizzo consente la creazione di un microambiente cellulare, che non può essere raggiunto nei tradizionali sistemi di coltura 2D. Questo sistema incoraggia e aumenta il mantenimento della pluripotenza attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione.
Le procedure tecniche qui descritte sono semplici strategie per consentire l’induzione e il mantenimento di uno stato di elevata plasticità nelle cellule somatiche adulte. Il protocollo ha permesso la derivazione di cellule ad alta plasticità in tutte le specie di mammiferi testate. Poiché non comporta l’uso della trasfezione genica ed è privo di vettori virali, può rappresentare un notevole progresso tecnologico per le applicazioni di medicina traslazionale. Inoltre, il sistema di micro-bioreattori fornisce un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali ricreando in vitro un microambiente specifico che consente la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità, vale a dire come ESC, iPSC, cellule epigeneticamente cancellate e MSC.
Introduction
Negli ultimi decenni, il concetto ampiamente accettato di progressione unidirezionale verso l’impegno e la differenziazione cellulare è stato completamente rivisto. È stato dimostrato che la specifica cellulare può essere invertita e una cellula differenziata terminalmente può essere spinta verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato, utilizzando metodi diversi.
Tra i diversi metodi proposti, uno dei metodi più promettenti prevede l’uso di composti chimici per indurre le cellule in una cosiddetta pluripotenza indotta chimicamente. Le piccole molecole utilizzate in questo approccio sono in grado di interagire e modificare la firma epigenetica di una cellula adulta matura, evitando la necessità di qualsiasi vettore transgenico e/o virale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosi studi hanno recentemente dimostrato che è possibile commutare le cellule da un fenotipo all’altro fornendo specifici stimoli biochimici e biologici che inducono la riattivazione dei geni ipermetilati 11,12,13,14,15. Questi eventi demetilanti consentono la conversione di cellule terminalmente differenziate in un progenitore primitivo, una cellula multipotente o ad alta plasticità/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallelamente, molti studi si sono recentemente concentrati sulla comprensione dei segnali correlati al meccanosensimento e, più specificamente, sulla possibilità di utilizzare forze meccaniche per influenzare direttamente la plasticità cellulare e/o la differenziazione 16,17,18,19. In effetti, è stato chiaramente dimostrato che la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo chiave nel controllo del destino cellulare. In particolare, i segnali biomeccanici e biofisici prodotti dall’ECM regolano direttamente i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione, influenzando il comportamento e le funzioni cellulari20,21. Questi dati recenti hanno spianato la strada allo sviluppo di nuovi sistemi di coltura 3D che imitano più da vicino il microambiente cellulare in vivo, replicando stimoli meccanici e fisici che guidano il comportamento cellulare.
Descriviamo qui un protocollo in due fasi che combina l’uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Nella prima fase, le cellule vengono incubate con la molecola demetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Questo agente è in grado di indurre una significativa demetilazione globale del DNA attraverso un effetto combinato dell’azione diretta 8,10 mediata dalla traslocazione di dieci-undici (TET2) e l’inibizione indiretta delle DNA metiltransferasi (DNMT)22,23. Questo passaggio induce la rimozione dei blocchi epigenetici con una successiva riattivazione dell’espressione genica correlata alla pluripotenza e, quindi, la generazione di cellule ad alta plasticità 1,2,3,8,10, di seguito denominate “cellule epigeneticamente cancellate”. Nella seconda fase, le celle sono incapsulate in un sistema di coltura 3D. A tal fine, il composto sintetico idrofobo non reattivo politetrafluoroetilene (PTFE; con dimensione delle particelle di 1 μm) viene utilizzato come micro-bioreattore, che consente la creazione di un microambiente cellulare irraggiungibile attraverso l’utilizzo di sistemi di coltura 2D tradizionali10. Le particelle di polvere di PTFE aderiscono alla superficie della goccia liquida in cui le cellule vengono nuovamente sospese e isolano il nucleo liquido dalla superficie di supporto, consentendo allo stesso tempo lo scambio di gas tra il liquido interno e l’ambiente circostante24. Il “micro-bioreattore PTFE” così ottenuto, noto anche come “Liquid Marble”, incoraggia le cellule a interagire liberamente tra loro, promuovendo il riarrangiamento cellulare 3D 25,26,27, ed estende e mantiene stabilmente lo stato di plasticità elevata acquisito attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi decenni, diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per invertire una cellula differenziata terminale verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato. Il protocollo qui descritto consente la generazione e il mantenimento a lungo termine di cellule pluripotenti a partire da cellule adulte mature differenziate terminalmente. Il metodo combina due passaggi indipendenti che comportano l’induzione di un elevato stato permissivo che si ottiene attraverso la cancellazione chimica epigene…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da Fondazione Carraresi e MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tutti gli autori sono membri del COST Action CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referencias
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