Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren
Summary
We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.
Abstract
Celfenotype kan worden omgekeerd of gewijzigd met verschillende methoden, met voordelen en beperkingen die specifiek zijn voor elke techniek. Hier beschrijven we een nieuwe strategie die het gebruik van chemische epigenetische uitwissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen, om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren. Er zijn twee belangrijke stappen vereist. In de eerste stap worden volwassen volwassen (terminaal gedifferentieerde) cellen blootgesteld aan de epigenetische gum 5-aza-cytidine om ze in een pluripotente toestand te drijven. Dit deel van het protocol is ontwikkeld, gebaseerd op het toenemende begrip van de epigenetische mechanismen die het lot en de differentiatie van cellen beheersen, en omvat het gebruik van de epigenetische modifier om de celgedifferentieerde toestand te wissen en vervolgens in een voorbijgaand venster met hoge plasticiteit te rijden.
In de tweede stap worden gewiste cellen ingekapseld in microbioreactoren van polytetrafluorethyleen (PTFE), ook bekend als Liquid Marbles, om de herschikking van 3D-cellen te bevorderen om de verworven hoge plasticiteit uit te breiden en stabiel te behouden. PTFE is een niet-reactieve hydrofobe synthetische verbinding en het gebruik ervan maakt het mogelijk een cellulaire micro-omgeving te creëren, die niet kan worden bereikt in traditionele 2D-kweeksystemen. Dit systeem stimuleert en verhoogt het behoud van pluripotentie door middel van bio-mechanosensing-gerelateerde signalen.
De hier beschreven technische procedures zijn eenvoudige strategieën om de inductie en het onderhoud van een hoge plasticiteitstoestand in volwassen somatische cellen mogelijk te maken. Het protocol maakte de afleiding van cellen met een hoge plasticiteit mogelijk in alle geteste zoogdiersoorten. Aangezien het geen gebruik van gentransfectie inhoudt en vrij is van virale vectoren, kan het een opmerkelijke technologische vooruitgang betekenen voor translationele geneeskundetoepassingen. Bovendien biedt het microbioreactorsysteem een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïdetechnologie door in vitro een specifieke micro-omgeving te creëren die de langetermijncultuur van cellen met een hoge plasticiteit mogelijk maakt, namelijk als SER’s, iPSC’s, epigenetisch gewiste cellen en MSC’s.
Introduction
Gedurende de laatste decennia werd het algemeen aanvaarde concept van unidirectionele progressie naar celbetrokkenheid en differentiatie volledig herzien. Het is aangetoond dat celspecificatie kan worden omgekeerd en dat een terminaal gedifferentieerde cel met behulp van verschillende methoden naar een minder toegewijde en hogere permissieve toestand kan worden geduwd.
Van de verschillende voorgestelde methoden is een van de meest veelbelovende methoden het gebruik van chemische verbindingen om cellen te induceren in een zogenaamde chemisch geïnduceerde pluripotentie. De kleine moleculen die in deze benadering worden gebruikt, zijn in staat om te interageren en de epigenetische signatuur van een volwassen volwassen cel te wijzigen, waardoor de noodzaak van transgene en / of virale vector 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 wordt vermeden . Talrijke studies hebben onlangs aangetoond dat het mogelijk is om cellen van het ene fenotype naar het andere te schakelen door specifieke biochemische en biologische stimuli te bieden die de reactivering van gehypermethyleerde geneninduceren 11,12,13,14,15. Deze demethylerende gebeurtenissen maken de omzetting van terminaal gedifferentieerde cellen in een primitieve voorloper, een multipotent of een hoge plasticiteit/pluripotente cel 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 mogelijk.
Tegelijkertijd hebben veel studies zich onlangs gericht op het begrijpen van mechanosensing-gerelateerde signalen en, meer specifiek, op de mogelijkheid om mechanische krachten te gebruiken om celplasticiteit en / of differentiatie direct te beïnvloeden 16,17,18,19. Het is inderdaad duidelijk aangetoond dat de extracellulaire matrix (ECM) een sleutelrol speelt in de controle van het lot van cellen. In het bijzonder reguleren de biomechanische en biofysische signalen geproduceerd door ECM direct moleculaire mechanismen en signaalroutes, waardoor het gedrag en de functies van cellen worden beïnvloed20,21. Deze recente gegevens hebben de weg vrijgemaakt voor de ontwikkeling van nieuwe 3D-kweeksystemen die de in vivo celmicro-omgeving beter nabootsen en mechanische en fysieke stimuli repliceren die het celgedrag sturen.
We beschrijven hier een tweestapsprotocol dat het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen, om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren. In de eerste stap worden cellen geïncubeerd met het demethylerende molecuul 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Dit middel is in staat om een significante globale DNA-demethylering te induceren door een gecombineerd effect van de directe ten-eleven translocatie 2 (TET2)-gemedieerde actie 8,10 en de indirecte remming van de DNA-methyltransferasen (DNMT)22,23. Deze stap induceert de verwijdering van de epigenetische blokken met een daaropvolgende heractivering van pluripotentie-gerelateerde genexpressie en dus de generatie van cellen met een hoge plasticiteit 1,2,3,8,10, hierna “epigenetisch gewiste cellen” genoemd. In de tweede stap worden cellen ingekapseld in een 3D-kweeksysteem. Hiertoe wordt de niet-reactieve hydrofobe synthetische verbinding polytetrafluorethyleen (PTFE; met een deeltjesgrootte van 1 μm) gebruikt als microbioreactor, die het mogelijk maakt een cellulaire micro-omgeving te creëren die onhaalbaar is door het gebruik van traditionele 2D-kweeksystemen10. De PTFE-poederdeeltjes hechten zich aan het oppervlak van de vloeistofdruppel waarin cellen opnieuw worden gesuspendeerd en isoleren de vloeibare kern van het ondersteunende oppervlak, terwijl gasuitwisseling tussen de inwendige vloeistof en de omgevingmogelijk is 24. De aldus verkregen “PTFE-microbioreactor”, ook bekend als “Liquid Marble”, moedigt cellen aan om vrij met elkaar te communiceren, bevordert 3D-celherschikking 25,26,27, en verlengt en handhaaft stabiel de verworven hoge plasticiteitstoestand door middel van bio-mechanosensing-gerelateerde signalen 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen decennia hebben verschillende studies zich gericht op de ontwikkeling van strategieën om een terminaal gedifferentieerde cel terug te brengen naar een minder toegewijde en hogere permissieve toestand. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om pluripotente cellen te genereren en op lange termijn te onderhouden, te beginnen met volwassen volwassen terminaal gedifferentieerde cellen. De methode combineert twee onafhankelijke stappen die de inductie van een hoge permissieve toestand omvatten die wor…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en MiND FoodS Hub ID: 1176436. Alle auteurs zijn lid van de COST Action CA16119 In vitro 3-D totale celgeleiding en fitness (CellFit).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
Referencias
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2′-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
