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Bioingeniería

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Published: November 02, 2020
doi:
10.3791/61791
,
1Department of Biology,Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Abstract

La biostampa sta emergendo come uno strumento promettente per fabbricare modelli di cancro umano 3D che ricapitolano meglio i tratti distintivi critici dell’architettura tissutale in vivo. Nell’attuale biostamma di estrusione strato per strato, le singole cellule vengono estruse in un bioink insieme a complessi segnali spaziali e temporali per promuovere l’auto-assemblaggio gerarchico dei tessuti. Tuttavia, questa tecnica di biofabbricazione si basa su interazioni complesse tra cellule, bioinchiostri e segnali biochimici e biofisici. Pertanto, l’auto-assemblaggio può richiedere giorni o addirittura settimane, può richiedere bioinchiostri specifici e potrebbe non verificarsi sempre quando è coinvolto più di un tipo di cellula. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica per biostampare direttamente sferoidi epiteliali del seno 3D pre-formati in una varietà di bioinchiostri. Gli sferoidi epiteliali del seno 3D prestampati biostampati hanno sostenuto la loro vitalità e l’architettura polarizzata dopo la stampa. Abbiamo inoltre stampato gli sferoidi 3D su reti cellulari endoteliali vascolari per creare un modello di co-coltura. Pertanto, la nuova tecnica di biostamgrafia crea rapidamente un modello di seno umano 3D più fisiologicamente rilevante a costi inferiori e con una maggiore flessibilità rispetto alle tradizionali tecniche di biostamgrafia. Questa versatile tecnica di biostamce può essere estrapolata per creare modelli 3D di altri tessuti in bioinchiostri aggiuntivi.

Introduction

I modelli tumorali vascolarizzati in vitro 3D sono strumenti essenziali per lo studio meccanicistico della crescita e della metastasi del cancro. Per il cancro al seno in particolare, le cellule epiteliali del seno coltivate a Matrigel si organizzano in sferoidi polarizzati che assomigliano più da vicino all’architettura in vivo dell’acinomammario 1,2,3,4,5,6,7,8. La coltura cellulare epiteliale del seno 3D influisce anche sulla funzione cellulare, con colture 3D che mostrano differenze nella modulazione del recettore del fattore di crescita epidermica (EGF)8,9; funzione oncogene, compreso ErbB210; crescita e apoptosi segnalando11,12; e resistenza allachemioterapia 13,14. Le cellule endoteliali vascolari rispondono in modo diverso agli stimoli ambientali in 3D rispetto alla coltura 2Dtradizionale 15,16,17,18. Tuttavia, gran parte della comprensione delle interazioni endoteliali vascolari e epiteliali del seno proviene da coltura 2D utilizzando inserti condizionati di mezzo o Transwell, o modelli 3D in cui i due tipi di cellule sono fisicamenteseparati 19,20,21,22,23. Questi modelli di co-coltura forniscono una visione fisiologica limitata, poiché sia la coltura 3D che il contatto cellulare-cellulare sono fondamentali per le interazioni endoteliali vascolari – cellule epiteliali del seno24,25,26.

I modelli di cancro 3D sono stati fabbricati utilizzando una varietà di tecniche, tra cui la formazione di sferoidi a goccia appesa, la biostamce, l’assemblaggio magnetico e la coltura all’interno di idrogel osu impalcature ingegnerizzate 5,27,28,29. Più recentemente, i modelli di tumore 3D sono stati creati con più tipi di cellule disposte nelle rispettive strutture 3D. In un esempio di piattaforma tumorale su chip, il cancro, le cellule endoteliali e stromali sono state mescolate in una matrice e quindi iniettate nelle tre camere del tessuto centrale in un dispositivo polidimetilossano (PDMS). Le camere tissutali erano delimitate da due canali esterni che rappresentavano un’arteria e una venula. Dopo 5-7 giorni di coltura, le cellule endoteliali formarono una rete microvascolare e le cellule tumorali proliferarono per formare piccoli tumori vicino alla vascolarizzazione. Questa piattaforma è stata quindi utilizzata per migliorare le combinazioni di farmacie farmaci 30. Ulteriori piattaforme tumorali su chip sono state create per studiare metastasi e tipi di cancro con stimoli meccanici specifici (ad esempio, ceppo meccanico nel polmone)31,32. Tuttavia, queste piattaforme generalmente non includono sia la vascucolatura che il cancro nelle rispettive strutture 3D.

La biofabbricazione mostra grandi promesse nell’avanzamento dei modelli di tumore vascolarizzato 3D in vitro, poiché consente uno stretto controllo spaziale sulla posizione delle cellule. Nonostante la crescita della biostampa nell’ultimo decennio, pochi studi si concentrano specificamente sui tumori33,34. In un esempio, la stampa 3D di cellule HeLa in un idrogel gelatinoso/alginato/fibrinogeno è stata utilizzata per creare un modello di cancro cervicale in vitro. Le cellule tumorali sono state biostampate come singole cellule e quindi hanno permesso di formare sferoidi, che hanno mostrato un più alto tasso di proliferazione, un aumento dell’espressione metalloproteinasi della matrice e una maggiore chemioresistenza rispetto alle cellule nella coltura 2D35. In questi studi, come in molti altri36,37, le sospensioni cellulari dissociate sono state biostampate, e poi alle colture cellulari sono stati forniti i segnali meccanici e biochimici necessari per consentire alle cellule di formare una struttura 3D. Tuttavia, l’auto-assemblaggio cellulare può richiedere giorni o settimane, può richiedere segnali ambientali spaziali e temporali complessi o non può verificarsi quando due tipi di cellule sono co-coltivati. Ad esempio, le cellule epiteliali del seno hanno indotto la morte cellulare nelle cellule endoteliali in co-coltura 2D e le cellule epiteliali del seno dissociate non hanno formato sferoidi 3D quando biostampate in idrogel di alginato / gelatina38. Le cellule epiteliali o tumorali del seno dissociate formavano sferoidi in bioinchiostri a base di alginato solo quando intrappolati in stampi PDMS circolari. In altri casi, gli sferoidi sono stati formati utilizzando goccioline sospese in piastre circolari ad attacco ultra-basso e quindi mescolati in bioinchiostri a base di alginato39,40.

In questo protocollo descriviamo ora un metodo alternativo di biofabbricazione dei tessuti 3D. Piuttosto che seminare cellule dissociate e aspettare che queste cellule formino le strutture 3D, descriviamo come creare e biostampare sferoidi tumorali 3D su una rete di tubi vascolari per creare un modello di co-coltura tumorale che può essere utilizzato quasi immediatamente. Gli sferoidi tumorali possono essere coltivati in vitro o derivati da tessuti umani (organoidi). Allo stesso modo, i tubi vascolari possono essere coltivati o possono essere derivati da frammenti microvascolari del tessuto adiposo. I bioinchiaci possono variare dall’alginato biologicamente inattivo al Matrigel41 altamente biologicamente attivo. Poiché questo modello di co-coltura tumorale 3D può essere creato con una varietà di strutture cellulari e bioinchiostri, può incorporare più tipi di cellule, matrici extracellulari e gradienti di chemiochina15,42. Mentre nella sua formulazione attuale, le reti endoteliali non possono essere perfuse, le iterazioni future potrebbero integrare questo metodo con microfluidi o sistemi -on-chip. La biostampa di sferoidi epiteliali del seno 3D su reti endoteliali consente una rapida biofabbricazione dei modelli mammari umani per il test dei farmaci e la medicina diprecisione personalizzata 27.

Protocol

1. Crescita delle cellule epiteliali del seno e mezzi di dosaggio Cellule epiteliali del seno MCF10ANOTA: La linea cellulare epiteliale del seno immortalato non tumorigenica è derivata da un paziente con malattia fibrocistica43. Le cellule non esprimono il recettore degli estrogeni. Per preparare 20 μg/mL di fattore di crescita epidermico (FEG), sciogliere 100 μg di FEG liofilizzato in 500 μL di dHsterile 2O per fare 200 μg/mL FEG. Aggiungere 500 μL di 200 μ…

Representative Results

Le cellule epiteliali del seno dovrebbero auto-organizzarsi in sferoidi 3D dopo 5-8 giorni di coltura su soluzione matriciale e in mezzo di coltura con soluzione matriciale al 2%. Gli sferoidi epiteliali al seno MCF10A non cancerogeni dovrebbero apparire rotondi e avere un centro cavo, con l’integrina α6 polarizzata al bordo esterno dello sferoide(Figura 1, l’interno mostra centri cavi). Le cellule epiteliali del cancro al seno MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari. Gli …

Discussion

Questo protocollo è il primo del suo genere a biostampare sferoidi nella loro architettura 3D per la co-coltura con cellule endoteliali anche nella loro architettura 3D. I passaggi critici del protocollo includono la formazione iniziale di sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC. Estrema cautela deve essere presa nell’alimentazione degli sferoidi epiteliali del seno, in quanto sono facilmente interrotti dalla soluzione matriciale. Allo stesso modo, gli sferoidi epiteliali del seno devono essere trattati con cura quand…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata da NIH 1R01HL140239-01 ad AMC. Ringraziamo il Cell Imaging Center della Drexel University.

Materials

37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity Sanyo MCO-20AIC Cell incubation
3D Bio printer custom-made None Used for bioprinting
8-well chamber slides VWR, Radnor, PA 53106-306 for seeding spheroids
25-gauge needle Sigma, St. Louis, MO Z192406-100EA bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof ) Sigma, St.Louis, MO E7023-500ML reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115006020 secondary block – Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200) Thermo Fisher, Waltham, MA A-11006 Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin Sigma, St.Louis, MO I-035-0.5ML MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA) Sigma, St.Louis, MO A2153-500G Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning, Corning, NY 352350 Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye Thermo Fisher, Waltham, MA C34552 pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge Hermle- Labnet, Edison ,NJ Z206A For cell centrifugations
Cholera Toxin Sigma, St.Louis, MO C8052-.5MG MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 62406-200 Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter Thermo Fisher, Waltham, MA AMQAF1000 counting cells
Glass pipettes (10 mL) VWR, Radnor, PA 76184-746 cell resuspension
DMEM F:12 Thermo Fisher, Waltham, MA 11320033 MCF10A basal media
DMEM 1X VWR, Radnor, PA 10-014-CV MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Durham, NC CC-3156 HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Lonza, Durham, NC CC-3162 Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin Thermo Fisher, Waltham, MA Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum Cytiva, Logan, UT SH30071.03 HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16210064 Live and dead cell stain assay for cell viability
Glycine Sigma, St.Louis, MO G8898-500G immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342 Thermo Fisher, Waltham, MA 62249 Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16050130 MCF10A Media additive
Hydrocortisone Sigma, St.Louis, MO H0888-5G MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) Cell applications, San Diego , CA 200-05f Endothelial cell lines
Integrin α6 Millipore, Billerica, MA MAB1378 Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay Thermo Fisher, Waltham, MA L3224 Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NY Used to visualize cells
Matrigel – growth factor reduced 10 mg/ml VWR, Radnor, PA 354230 Spheroid formation
MCF10A cells ATCC CRL-10317 Breast cell line
MDA-MB-231 cells ATCC HTB-26 Breast cell line
Paraformaldehyde Sigma, St.Louis, MO 158127-500G cell fixative
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher, Waltham, MA 15140122 MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) Thermo Fisher, Waltham, MA 7001106 Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X Thermo Fisher, Waltham, MA AM9625 immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade Thermo Fisher, Waltham, MA P36934 immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF Peprotech, Rocky Hill, NJ AF-100-15 MCF10A/ assay media component
Sodium Azide Sigma, St.Louis, MO S2002-25G immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL) VWR, Radnor, PA 75846-757 bioprinting process
Tissue culture dish (10cm) VWR, Radnor, PA 25382-166 monolayer cell culture
Triton X-100 Sigma, St.Louis, MO T8787-250ML immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4% Thermo Fisher, Waltham, MA 15250061 cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher, Waltham, MA 25300054 cell detachment
Tween -20 Thermo Fisher, Waltham, MA 85113 immunofluorescence buffer component
>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) Peprotech, Rocky Hill, NJ 100-20 HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software PerkinElmer, Hopkinton, MA Z stack compresser
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Referencias

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Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks. J. Vis. Exp. (165), e61791, doi:10.3791/61791 (2020).
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