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Bioingeniería

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

Published: November 02, 2020
doi:
10.3791/61791
,
1Department of Biology,Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

このプロトコルの目的は、多細胞スフェロイドとして乳房上皮細胞を、薬物スクリーニング研究に使用できる3D乳房内皮共培養モデルを迅速に作成するために、多細胞性スフェロイドとして直接バイオプリントすることです。

Abstract

バイオプリンティングは、生体組織アーキテクチャの重要な特徴をより良く再現する3Dヒトがんモデルを製造するための有望なツールとして浮上しています。現在のレイヤーごとの押出バイオプリンティングでは、個々の細胞が複雑な空間的および一時的な手がかりと共にバイオインクで押し出され、階層組織の自己集合を促進します。しかし、このバイオファブリケーション技術は、細胞間の複雑な相互作用、バイオインク、生化学的および生物物理学的手掛かりに依存しています。したがって、自己組立には数日または数週間かかる場合があり、特定のバイオインキを必要とすることがあり、複数の細胞タイプが関与している場合には必ずしも起こらない場合がある。そこで、様々なバイオインクで形成された3D乳房上皮スフェロイドを直接バイオプリントする技術を開発しました。バイオプリントされたプレフォーム3D乳房上皮スフェロイドは、印刷後の生存率と偏光アーキテクチャを維持した。さらに、3Dスフェロイドを血管内皮細胞ネットワークに印刷し、共培養モデルを作成しました。したがって、新しいバイオプリンティング技術は、従来のバイオプリンティング技術よりも低コストで柔軟性を持って、より生理学的に関連する3Dヒト乳房モデルを迅速に作成します。この多目的なバイオプリンティング技術は、追加のバイオインクで他の組織の3Dモデルを作成するために外挿することができます。

Introduction

3D in vitro血管化腫瘍モデルは、がんの成長と転移の機械化研究に不可欠なツールです。特に乳癌の場合、マトリゲルで培養された乳房上皮細胞は、生体内乳腺アシヌスアーキテクチャ1、2、3、4、5、6、7、8に似た偏光スフェロイドに整理する。3D乳房上皮細胞培養も細胞機能に影響を与え、表皮成長因子(EGF)受容体変調8、9の違いを示す3D培養で、オンコジーン機能, ErbB210を含む;成長とアポトーシスシグナル11、12;と化学療法抵抗13,14.血管内皮細胞は、従来の2D培養15、16、17、18との3Dと同様に環境刺激に対して異なる反応を示す。しかし、血管内皮および乳房上皮相互作用の理解の多くは、2D培養に条件付き培地またはトランスウェル挿入物を用い、または2つの細胞タイプが物理的に19、20、21、22、23に分離された3Dモデルから来ている。これらの共培養モデルは、3D培養と細胞-細胞接触の両方が血管内皮に重要であるので、限られた生理学的洞察力を提供する – 乳房上皮細胞相互作用24,25,26.

3Dがんモデルは、ヒドロゲル内または設計された足場5、27、28、29の中で、吊り下げスフェロイド形成、バイオプリンティング、磁気アセンブリ、培養を含む様々な技術を用いて製造されている。最近では、3D腫瘍モデルが、それぞれの3D構造に配置された複数の細胞タイプで作成されました。腫瘍オンチッププラットフォームの一例では、癌、内皮細胞、および間質細胞をマトリックスに混合し、次いでポリジメチルシロキサン(PDMS)装置の中の3つの中央組織室に注入した。組織室は、動脈と静脈を表す2つの外側のチャネルで接していた。培養の5〜7日後、内皮細胞は血管系の近くに小さな腫瘍を形成するために増殖した微小血管網と癌細胞を形成した。このプラットフォームは、その後、スクリーニング薬と薬物の組み合わせ30に使用されました。特定の機械的刺激(例えば、肺の機械的緊張)31,32を有する転移および癌タイプを研究するために、追加の腫瘍オンチッププラットフォームが作成された。しかし、これらのプラットフォームは、一般的にそれぞれの3D構造に血管系と癌の両方を含みはありません。

バイオファブリケーションは、細胞の位置を厳密に空間制御できるため、3D in vitro血管化腫瘍モデルを進める上で大きな約束を示しています。過去10年間のバイオプリンティングの成長にもかかわらず、腫瘍33、34に特に焦点を当てた研究はほとんどありません。ある例では、ゼラチン/アルギン酸/フィブリノーゲンヒドロゲル中のHeLa細胞の3Dプリンティングを使用して、インビトロ子宮頸癌モデルを作成した。腫瘍細胞を個々の細胞としてバイオプリントし、次いでスフェロイドを形成させ、これはより高い増殖速度、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の増加、および2D培養35における細胞よりも高い化学抵抗性を示した。これらの研究では、他の多くの36,37と同様に、解ciaciaされた細胞懸濁液をバイオプリントし、次に細胞培養物に必要な機械的および生化学的手掛かりを与えて細胞が3D構造を形成することを可能にした。しかし、細胞自己集合は数日または数週間かかる場合があり、複雑な空間的および時間的環境的手掛かりを必要とすることがあり、または2つの細胞タイプが共同培養される場合には起こらない場合がある。例えば、2D共培養において内皮細胞における細胞死を誘導した乳房上皮細胞、および解約乳房上皮細胞は、アルギン酸/ゼラチンヒドロゲル38にバイオプリントした際に3Dスフェロイドを形成しなかった。解体乳房上皮または癌細胞は、円形PDMS型に包絡された場合にのみ、アルギン酸塩ベースのバイオインクでスフェロイドを形成した。他の場合には、スフェロイドは、超低添付着円状ウェルプレート中に懸濁液滴を使用して形成し、次いでアルギン酸系バイオインク39,40に混合した。

このプロトコルでは、代替3D組織バイオマニュファクチャリング法について説明します。解約細胞を播種してこれらの細胞が3D構造を形成するのを待つのではなく、血管管ネットワーク上に3D腫瘍回転楕円体を作成してバイオプリントし、ほぼ即座に使用できる腫瘍共培養モデルを作成する方法を説明する。腫瘍スフェロイドは、インビトロで成長させるか、またはヒト組織(オルガノイド)に由来する。同様に、血管管は、微小血管断片の脂肪組織に由来することができるか、または成長させることができる。バイオインクは、生物学的に不活性なアルギン酸から、生物学的に活性の高いマトリゲル41まで及ぶ。この3D腫瘍共培養モデルは、様々な細胞構造およびバイオインクを用いて作成することができるので、複数の細胞型、細胞外マトリックス、およびケモカイン勾配15、42を組み込むことができる。現在の製剤では、内皮ネットワークを浸透させることはできませんが、将来の反復は、この方法をマイクロ流体またはオンチップシステムと統合することができます。内皮ネットワーク上のバイオプリンティング3D乳房上皮スフェロイドは、薬物検査および個別の精密医療27のためのヒト乳房モデルの迅速なバイオファブリケーションを可能にする。

Protocol

1. 乳房上皮細胞の増殖とアッセイ培地 MCF10A乳房上皮細胞注:非腫瘍化不死化乳房上皮細胞株は、線維嚢胞性疾患43を有する患者由来である。細胞はエストロゲン受容体を発現しません。 20 μg/mL 表皮成長因子(EGF)を調製するために、凍結乾燥したEGFの100 μgを500 μLの無菌dH2Oに溶解し、200 μg/mL EGF を作ります。200 μg/mL EGF の 500 μL を dH2O の無菌 0….

Representative Results

乳房上皮細胞は、マトリックス溶液上および2%マトリックス溶液を有する培養培地で5〜8日後に3Dスフェロイドに自己組織化すべきである。非腫瘍性MCF10A乳房上皮スフェロイドは円形に見え、中空中心を有し、インテグリンα6はスフェロイドの外縁に偏光している(図1、差し込みは中空の中心を示す)。高侵襲性MDA-MB-231乳癌上皮細胞は不規則なスフェロイドを形成する。回…

Discussion

このプロトコルは、3Dアーキテクチャにおいても内皮細胞との共培養のための3Dアーキテクチャにおけるバイオプリントスフェロイドの初のプロトコルです。重要なプロトコルステップには、乳房上皮スフェロイドおよびHUVECネットワークの初期形成が含まれる。乳房上皮スフェロイドはマトリックス溶液から容易に破壊されるため、授乳中には細心の注意が必要です。同様に、乳房上皮スフ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH 1R01HL140239-01によってAMCに資金提供されました。ドレクセル大学の細胞イメージングセンターに感謝します。

Materials

37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity Sanyo MCO-20AIC Cell incubation
3D Bio printer custom-made None Used for bioprinting
8-well chamber slides VWR, Radnor, PA 53106-306 for seeding spheroids
25-gauge needle Sigma, St. Louis, MO Z192406-100EA bioprinting syringe needle
Absolute ethanol (200 proof ) Sigma, St.Louis, MO E7023-500ML reconsitution of media components
Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115006020 secondary block – Immunofluorescence
Alexa Fluor 488 (1:200) Thermo Fisher, Waltham, MA A-11006 Seconday antibody-Immunofluorescence
Bovine insulin Sigma, St.Louis, MO I-035-0.5ML MCF10A Media additive
Bovine serum albumin (BSA) Sigma, St.Louis, MO A2153-500G Blocking agent -Immunofluorescence
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning, Corning, NY 352350 Remove large or clustered spheroids
CellTracker™ Red CMTPX Dye Thermo Fisher, Waltham, MA C34552 pre-stain for HUVEC tubes
Compact Centrifuge Hermle- Labnet, Edison ,NJ Z206A For cell centrifugations
Cholera Toxin Sigma, St.Louis, MO C8052-.5MG MCF10A Media additive
Conical tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 62406-200 Collecting and resuspending cells
Countess II-FL Cell counter Thermo Fisher, Waltham, MA AMQAF1000 counting cells
Glass pipettes (10 mL) VWR, Radnor, PA 76184-746 cell resuspension
DMEM F:12 Thermo Fisher, Waltham, MA 11320033 MCF10A basal media
DMEM 1X VWR, Radnor, PA 10-014-CV MDA-MB-231 basal media
Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza, Durham, NC CC-3156 HUVEC basal media
Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Lonza, Durham, NC CC-3162 Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)
Alexa Fluor™ 488 Phalloidin Thermo Fisher, Waltham, MA Labelling MDA-MB-231 spheroids
Fetal Bovine serum Cytiva, Logan, UT SH30071.03 HUVEC/MDA-MB-231 media additive
Goat serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16210064 Live and dead cell stain assay for cell viability
Glycine Sigma, St.Louis, MO G8898-500G immunofluorescence buffer component
Hoescht 33342 Thermo Fisher, Waltham, MA 62249 Nuclei stain immunofluorescence
Horse Serum Thermo Fisher, Waltham, MA 16050130 MCF10A Media additive
Hydrocortisone Sigma, St.Louis, MO H0888-5G MCF10A Media additive
Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) Cell applications, San Diego , CA 200-05f Endothelial cell lines
Integrin α6 Millipore, Billerica, MA MAB1378 Immunofluorescence spheroid labelling component
Live Dead assay Thermo Fisher, Waltham, MA L3224 Live and dead cell stain assay for cell viability
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NY Used to visualize cells
Matrigel – growth factor reduced 10 mg/ml VWR, Radnor, PA 354230 Spheroid formation
MCF10A cells ATCC CRL-10317 Breast cell line
MDA-MB-231 cells ATCC HTB-26 Breast cell line
Paraformaldehyde Sigma, St.Louis, MO 158127-500G cell fixative
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher, Waltham, MA 15140122 MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive
Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) Thermo Fisher, Waltham, MA 7001106 Wash buffer for cells before trypsinization
Phosphate buffer saline 10X Thermo Fisher, Waltham, MA AM9625 immunofluorescence buffer component
Prolong gold antifade Thermo Fisher, Waltham, MA P36934 immunofluorescence mountant medium
Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF Peprotech, Rocky Hill, NJ AF-100-15 MCF10A/ assay media component
Sodium Azide Sigma, St.Louis, MO S2002-25G immunofluorescence buffer component
Sterile syringe (10 mL) VWR, Radnor, PA 75846-757 bioprinting process
Tissue culture dish (10cm) VWR, Radnor, PA 25382-166 monolayer cell culture
Triton X-100 Sigma, St.Louis, MO T8787-250ML immunofluorescence buffer component
Trypan blue 0.4% Thermo Fisher, Waltham, MA 15250061 cell counter additive
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher, Waltham, MA 25300054 cell detachment
Tween -20 Thermo Fisher, Waltham, MA 85113 immunofluorescence buffer component
>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) Peprotech, Rocky Hill, NJ 100-20 HUVEC tube additive
Volocity 6.3 cell imaging software PerkinElmer, Hopkinton, MA Z stack compresser
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Referencias

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Swaminathan, S., Clyne, A. M. Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks. J. Vis. Exp. (165), e61791, doi:10.3791/61791 (2020).
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