Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Summary

El objetivo de este protocolo es bioimprimir directamente las células epiteliales mamarias como esferoides multicelulares en redes endoteliales preformadas para crear rápidamente modelos de co-cultivo endotelial mamario 3D que pueden ser utilizados para estudios de detección de fármacos.

Abstract

La bioimpresión está emergiendo como una herramienta prometedora para fabricar modelos de cáncer humano 3D que recapitulan mejor las señas de identidad críticas de la arquitectura de tejidos in vivo. En la bioimpresión actual de extrusión capa por capa, las células individuales se extruyen en un bioink junto con señales espaciales y temporales complejas para promover el autoensamblaje del tejido jerárquico. Sin embargo, esta técnica de biofabricación se basa en interacciones complejas entre células, bioinks y señales bioquímicas y biofísicas. Por lo tanto, el autoensamblaje puede tomar días o incluso semanas, puede requerir bioinks específicos, y no siempre puede ocurrir cuando hay más de un tipo de célula involucrado. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para bioimprimir directamente esferoides epiteliales de mama 3D preformados en una variedad de bioinks. Los esferoides epiteliales 3D preformados bioimpresos mantuvieron su viabilidad y arquitectura polarizada después de la impresión. Además imprimimos los esferoides 3D en redes celulares endoteliales vasculares para crear un modelo de co-cultivo. Por lo tanto, la novedosa técnica de bioimpresión crea rápidamente un modelo mamario humano 3D más fisiológicamente relevante a menor costo y con mayor flexibilidad que las técnicas tradicionales de bioimpresión. Esta versátil técnica de bioimpresión se puede extrapolar para crear modelos 3D de otros tejidos en bioinks adicionales.

Introduction

Los modelos tumorales vascularizados in vitro 3D son herramientas esenciales para el estudio mecanicista del crecimiento del cáncer y la metástasis. Para el cáncer de mama en particular, las células epiteliales mamarias cultivadas en Matrigel se organizan en esferoides polarizados que se asemejan más a la arquitectura in vivo mammary acinus^{1,2,3,4,5,6,7,8.} Cultivo celular epitelial mamario 3D también afe....

Protocol

1. Crecimiento de células epiteliales mamarias y medios de ensayo

1. Células epiteliales mamarias MCF10A
   NOTA: La línea celular epitelial mamaria inmortalizada no tumorigénica se deriva de una paciente con enfermedad fibroquística^43. Las células no expresan el receptor de estrógeno.
   1. Para preparar 20 μg/mL factor de crecimiento epidérmico (EGF), disolver 100 μg de EGF liofilizado en 500 μL de dH estéril₂O para hacer 200 μg/mL EGF. Añadir 500 μL de 200 μg/mL de EGF en 4,5 ml de BSA estéril del 0,1% en dH₂O para hacer una solución de stock de EGF de 20 μg/mL. Almacene los alíquesas de EGF preparados de 20 μg....

Results

Las células epiteliales mamarias deben autoorganización en esferoides 3D después de 5-8 días de cultivo en solución de matriz y en medio de cultivo con 2% solución de matriz. Los esferoides epiteliales de mama MCF10A no tumorigénicos deben aparecer redondos y tener un centro hueco, con integrina α6 polarizada al borde exterior del esferoide(Figura 1,inset muestra centros huecos). Las células epiteliales de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente invasivas forman esferoides irregulares. Los esfer.......

Discussion

Este protocolo es el primero de su tipo en bioimprimir esferoides en su arquitectura 3D para co-cultivo con células endoteliales también en su arquitectura 3D. Los pasos críticos del protocolo incluyen la formación inicial de esferoides epiteliales mamales y redes HUVEC. Se debe tener extrema precaución en la alimentación de esferoides epiteliales mamarios, ya que se interrumpen fácilmente de la solución de matriz. Del mismo modo, los esferoides epiteliales mamales deben tratarse con cuidado cuando se pipetizan fuera de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
37° Incubadora C, 5% de CO2 y 95% de humedad	Sanyo	MCO-20AIC	Incubación de células
Impresora biológica 3D	a medida	Ninguno	Se utiliza para la bioimpresión
portaobjetos de cámara de 8 pocillos	VWR, Radnor, PA	53106-306	para la siembra de esferoides
aguja de calibre 25	Sigma, St. Louis, MO	Z192406-100EA	aguja de jeringa de bioimpresión
Etanol absoluto (200 grados)	Sigma, St.Louis, MO	E7023-500ML	reconstitución de componentes de medios
Affinipure F(ab′)2 fragmentos de cabra anti-ratón IgG	Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA	115006020	bloque secundario - Inmunofluorescencia
Alexa Fluor 488 (1:200)	Thermo Fisher, Waltham, MA	A-11006	Anticuerpo secundario-Inmunofluorescencia
Insulina bovina	Sigma, St.Louis, MO	I-035-0.5ML	MCF10A Aditivo de medios
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma, St.Louis, MO	A2153-500G	Agente bloqueante -Inmunofluorescencia
Falcon 70 µ m Filtro de células	Corning, Corning, NY	352350	Eliminar esferoides grandes o agrupados
CellTracker™ Tinte rojo CMTPX Thermo	Fisher, Waltham, MA	C34552	pre-tinción para tubos HUVEC
Centrífuga compacta	Hermle- Labnet, Edison, NJ	Z206A	Para centrifugaciones celulares
Toxina del cólera	Sigma, St.Louis, MO	C8052-.5MG	MCF10A Aditivo para medios
Tubos cónicos 15 mL	VWR, Radnor, PA	62406-200	Recolección y resuspensión de células
Countess II-FL Contador de celdas	Thermo Fisher, Waltham, MA	AMQAF1000	células de recuento
Pipetas de vidrio (10 mL)	VWR, Radnor, PA	76184-746	resuspensión celular
DMEM F:12	Thermo Fisher, Waltham, MA	11320033	MCF10A medios basales
DMEM 1X	VWR, Radnor, PA	10-014-CV	MDA-MB-231 medios basales
Medio basal endotelial-2 (EBM-2)	Lonza, Durham, NC	CC-3156	HUVEC medios basales
Medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2)	Lonza, Durham, NC	CC-3162 Acompañado de	un kit de balas (que contiene factores de crecimiento)
Alexa Fluor™ 488 Faloidina	Thermo Fisher, Waltham, MA		Etiquetado MDA-MB-231 esferoides
Suero fetal bovino	Cytiva, Logan, UT	SH30071.03	HUVEC/MDA-MB-231 aditivo
Suero de cabra	Thermo Fisher, Waltham, MA	16210064	Componente de marcado de inmunofluorescencia
Glycine	Sigma, St.Louis, MO	G8898-500G	componente tampón de inmunofluorescencia
Hoescht 33342	Thermo Fisher, Waltham, MA	62249	Inmunofluorescencia con tinción de núcleos
Suero de caballo	Thermo Fisher, Waltham, MA	16050130	MCF10A Aditivo para medios
Hidrocortisona	Sigma, St.Louis, MO	H0888-5G	MCF10A Aditivo de medios
Células endoteliales de la vena umblical humana (HUVEC)Aplicaciones de	células, San Diego, CA	200-05f	Líneas celulares endoteliales
Integrina y alfa; 6	Millipore, Billerica, MA	MAB1378	Componente de marcado de esferoide de inmunofluorescencia
Ensayo de muertos vivos	Thermo Fisher, Waltham, MA	L3224	Ensayo de tinción de células vivas y muertas para la viabilidad celular
LSM 700 Microscopio confocal	Zeiss, Thornwood, NY		Se utiliza para visualizar células
Matrigel - factor de crecimiento reducido 10 mg/ml	VWR, Radnor, PA	354230	Esferoide formación
Células MCF10A	ATCC	CRL-10317	Línea celular de mama
MDA-MB-231 células	ATCC	HTB-26	Línea celular de mama
Paraformaldehído	Sigma, St.Louis, MO	158127-500G	fijador de células
Penicilina y estreptomicina	Thermo Fisher, Waltham, MA	15140122	MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Aditivo de medios
Fosfato tamponado Solución salina 1X (PBS)	Thermo Fisher, Waltham, MA	7001106	Tampón de lavado para células antes de la tripsinización
Tampón de fosfato solución salina 10X	Thermo Fisher, Waltham, MA	AM9625	componente tampón de inmunofluorescencia
Prolongue el antidecoloración del oro	Thermo Fisher, Waltham, MA	P36934	medio de montaje de inmunofluorescencia
factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, EGF	Peprotech, Rocky Hill, NJ	AF-100-15	MCF10A/ componente de medio
de ensayo Azida de sodio	Sigma, St.Louis, MO	S2002-25G	tampón de inmunofluorescencia
Jeringa estéril (10 mL)	VWR, Radnor, PA	75846-757	proceso de bioimpresión
Placa de cultivo de tejidos (10 cm)	VWR, Radnor, PA	25382-166	cultivo celular monocapa
Triton X-100	Sigma, St.Louis, MO	T8787-250ML	componente tampón de inmunofluorescencia
azul tripano 0,4%	Thermo Fisher, Waltham, MA	15250061	aditivo contador
de células Tripsina-EDTA 0,05%	Thermo Fisher, Waltham, MA	Desprendimiento	células
Tween -20	Thermo Fisher, Waltham, MA	85113	componente tampón de inmunofluorescencia
Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF165)	Peprotech, Rocky Hill, NJ	100-20	HUVEC aditivo
tubos Volocity 6.3 software de imagen celular	PerkinElmer, Hopkinton, MA		Compresor de pila Z