Прямая биопечать 3D многоклеточных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети
Summary
Целью этого протокола является непосредственно биопечать эпителиальных клеток молочной железы в качестве многоклеточных сфероидов на предварительно сформированные эндотелиальные сети для быстрого создания 3D эндотелиальных моделей совместной культуры груди, которые могут быть использованы для исследования скрининга наркотиков.
Abstract
Биопечать становится перспективным инструментом для изготовления 3D-моделей рака человека, которые лучше резюмируют критические признаки архитектуры тканей in vivo. В текущей биопечати экструзии слоя за слоем отдельные клетки экструдируются в биоинке вместе со сложными пространственными и временными сигналами для содействия самосожасыванию иерархических тканей. Тем не менее, этот метод биофабрики опирается на сложные взаимодействия между клетками, биоинки и биохимические и биофизические сигналы. Таким образом, самос сборка может занять несколько дней или даже недель, может потребовать конкретных биоинкв, и не всегда может произойти, когда есть более чем один тип клеток участие. Поэтому мы разработали метод непосредственно биопечати предварительно сформированных 3D груди эпителиальных сфероидов в различных биоинк. Биопечатные предварительно сформированные 3D эпителиальные сфероиды груди поддерживали свою жизнеспособность и поляризованную архитектуру после печати. Мы дополнительно напечатали 3D сфероиды на сосудистых эндотелиальных клеточных сетях, чтобы создать модель совместной культуры. Таким образом, новая методика биопечати быстро создает более физиологически релевантную 3D модель груди человека при более низких затратах и с более высокой гибкостью, чем традиционные методы биопечати. Этот универсальный метод биопечати может быть экстраполирован для создания 3D-моделей других тканей в дополнительных биоинках.
Introduction
3D в пробирке сосудистой опухоли модели являются важными инструментами для механистического исследования роста рака и метастазов. Для рака молочной железы, в частности, эпителиальные клетки молочной железы, культурные в Matrigel организовать в поляризованных сфероидов, которые больше напоминают in vivo mammary acinusархитектуры 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D груди эпителиальной клеточной культуры также влияет на функцию клеток, с 3D культур, показывающих различия в эпидермального фактора роста (EGF)модуляции рецепторов 8,9; онкоген функции, в том числе ErbB210; рост и апоптоз сигнализации11,12; ихимиотерапевтического сопротивления 13,14. Сосудистые эндотелиальные клетки одинаково по-разному реагируют на экологические стимулы в 3D против традиционной 2Dкультуры 15,16,17,18. Тем не менее, большая часть понимания сосудистых эндотелиальных и грудных эпителиальных взаимодействий происходит от 2D культуры с использованием условных средних или Transwell вставки, или 3D-модели, в которых два типаклеток физически разделены 19,20,21,22,23. Эти модели совместной культуры обеспечивают ограниченное физиологическое понимание, так как и 3D-культура, и контакт клеток имеют решающее значение для сосудистого эндотелиального – взаимодействияэпителиальных клеток молочной железы 24,25,26.
3D модели рака были изготовлены с использованием различных методов, в том числе висячие капли сфероидов формирования, биопечати, магнитной сборки и культуры в гидрогелях или на инженерии леса5,27,28,29. Совсем недавно были созданы 3D-модели опухолей с несколькими типами клеток, расположенными в их соответствующих 3D структурах. В одном из примеров опухоли на чипе платформы, рак, эндотелиальные и стромальные клетки были смешаны в матрицу, а затем введены в три центральные камеры ткани в устройстве polydimeylsiloxane (PDMS). Камеры тканей были граничит с двумя внешними каналами, которые представляли артерию и венуле. После 5-7 дней культуры, эндотелиальные клетки сформировали микрососудикулярную сеть и раковые клетки размножались, чтобы сформировать небольшие опухоли вблизи сосудов. Эта платформа была затем использована для проверки наркотиков и комбинаций наркотиков30. Дополнительные платформы опухоли-на-чипе были созданы для изучения метастазов и типов рака с конкретными механическими стимулами (например, механический штаммв легких) 31,32. Тем не менее, эти платформы, как правило, не включают как сосуды и рак в их соответствующих 3D структур.
Биофабрика показывает большие перспективы в продвижении 3D в пробирке васкуляризированных моделей опухоли, так как это позволяет жесткий пространственный контроль над расположением клеток. Несмотря на рост биопечати за последнее десятилетие, лишь немногие исследования сосредоточены конкретно наопухолях 33,34. В одном примере для создания модели рака шейки матки in vitro использовалась 3D-печать клеток HeLa в гидрогеле из желатина/альгината/фибриногена. Опухолевые клетки были биопечать в качестве отдельных клеток, а затем позволило сформировать сфероиды, которые показали более высокий уровень распространения, увеличение экспрессии матрицы металлопротеиназы, и более высокую химиорезистансность, чем клетки в 2Dкультуры 35. В этих исследованиях, как и вомногих других 36,37, диссоциированных клеточных суспензий были биопечати, а затем клеточные культуры были предоставлены необходимые механические и биохимические сигналы, чтобы клетки, чтобы сформировать 3D структуру. Тем не менее, клеточная самосвеывание может занять несколько дней или недель, может потребовать сложных пространственных и временных экологических сигналов, или не может произойти, когда два типа клеток совместно культуры. Например, эпителиальные клетки молочной железы индуцированных клеточной смерти в эндотелиальных клетках в 2D совместной культуры, и диссоциированных клеток груди эпителиальной не образуют 3D сфероидов, когда биопечать в альгинат / желатингидрогелий 38. Диссоциированные эпителиальные или раковые клетки молочной железы образуют сфероиды в биоинках на основе альгината только тогда, когда они в ловушке в круглых формах PDMS. В других случаях, сфероиды были сформированы с использованием подвесных капель в ультра-низкой крепления круговых пластин хорошо, а затем смешивается в альгинат наоснове биоинк 39,40.
Теперь в этом протоколе мы описываем альтернативный метод биофактирования 3D-тканей. Вместо того, чтобы семена диссоциированных клеток и ждать этих клеток, чтобы сформировать 3D структуры, мы описываем, как создать и биопечать 3D-сфероидов опухоли на сосудистой сети трубки для создания опухоли совместно культуры модели, которые могут быть использованы почти сразу. Опухолевые сфероиды могут быть выращены в пробирке или получены из тканей человека (органоидов). Аналогичным образом, сосудистые трубки могут быть выращены или могут быть получены из жировой ткани микрососудистых фрагментов. Биоинкс может варьироваться от биологически неактивного альгината до высоко биологически активного Matrigel41. Так как эта 3D-модель совместной культуры опухоли может быть создана с различными клеточными структурами и биоинками, она может включать в себя несколько типов клеток, внеклеточные матрицы, и химиокинградиенты 15,42. Хотя в своей нынешней формулировке эндотелиальные сети не могут быть пронизаны, будущие итерации могут интегрировать этот метод с микрофлюидами или системами-чипами. Биопечать 3D эпителиальных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети позволяет быстро биофабрикацию моделей груди человека для тестирования на наркотики и персонализированной точноймедицины 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол является первым в своем роде биопечать сфероидов в их 3D архитектуры для совместной культуры с эндотелиальных клеток также в их 3D архитектуры. Критические этапы протокола включают первоначальное образование сетей эпителиальных сфероидов молочной железы и HUVEC. Чрезвычайн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось NIH 1R01HL140239-01 для AMC. Мы хотели бы поблагодарить Центр визуализации клеток при Университете Дрекселя.
Materials
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block – Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel – growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| >Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
Referencias
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
