Conjugaison chimique d’un anticorps purifié dirigé vers DEC-205 avec une protéine pleine longueur pour cibler les cellules dendritiques de souris in vitro et in vivo
Summary
Nous décrivons un protocole pour la conjugaison chimique de l’antigène modèle ovalbumine à un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose pour le ciblage in vivo des cellules dendritiques. Le protocole comprend la purification de l’anticorps, la conjugaison chimique de l’antigène, ainsi que la purification du conjugué et la vérification de la conjugaison efficace.
Abstract
L’administration ciblée d’antigènes aux cellules dendritiques (DC) à présentation croisée in vivo induit efficacement des réponses aux cellules effectrices T et présente une approche précieuse dans la conception de vaccins. L’antigène est délivré à DC via des anticorps spécifiques aux récepteurs de l’endocytose tels que DEC-205 qui induisent l’absorption, le traitement et la présentation du CMH de classe I et II.
La conjugaison efficace et fiable de l’antigène souhaité à un anticorps approprié est une étape critique dans le ciblage DC et, entre autres facteurs, dépend du format de l’antigène. La conjugaison chimique de protéines pleine longueur en anticorps purifiés est une stratégie possible. Dans le passé, nous avons réussi à établir une réticulation de l’antigène modèle ovalbumine (OVA) et d’un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) pour des études in vivo de ciblage DC chez la souris. La première étape du protocole est la purification de l’anticorps du surnageant de l’hybridome NLDC (cellules dendritiques non lymphoïdes)-145 par chromatographie d’affinité. L’anticorps purifié est activé pour la conjugaison chimique par sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) tandis que dans le même temps les groupes sulfhydryle de la protéine OVA sont exposés par incubation avec TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine tris (2-carboxyéthyle)). L’excès de TCEP-HCl et de sulfo-SMCC est éliminé et l’antigène est mélangé à l’anticorps activé pour un couplage de nuit. Le conjugué αDEC-205/OVA qui en résulte est concentré et libéré des OVJ non liés. La conjugaison réussie de l’OVA à l’αDEC-205 est vérifiée par l’analyse par transfert western et le test immuno-enzymatique (ELISA).
Nous avons utilisé avec succès l’αDEC-205/OVA réticulé chimiquement pour induire des réponses cytotoxiques des lymphocytes T dans le foie et pour comparer différents adjuvants pour leur potentiel à induire une immunité humorale et cellulaire après un ciblage in vivo de DEC-205+ DC. Au-delà de cela, ces conjugués anticorps/antigènes couplés chimiquement offrent des outils précieux pour l’induction efficace des réponses vaccinales aux antigènes tumoraux et se sont avérés supérieurs aux approches d’immunisation classiques concernant la prévention et le traitement de divers types de tumeurs.
Introduction
Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs centraux du système immunitaire. Il s’agit d’un groupe diversifié de cellules spécialisées dans la présentation de l’antigène et leur fonction principale est de combler l’immunité innée et adaptative1,2. Il est important de noter que les DC jouent non seulement un rôle important dans les réponses efficaces et spécifiques dirigées par les agents pathogènes, mais sont également impliqués dans de nombreux aspects de l’immunité antitumorale1,3.
En raison de leur rôle exclusif dans l’immunité de l’hôte, DC est devenu une cible de la vaccination4. Une approche consiste à cibler les antigènes à DC in vivo pour induire des réponses immunitaires spécifiques à l’antigène et au cours des dernières années, un grand nombre d’études ont été consacrées à la définition de récepteurs appropriés et à des stratégies de ciblage1,4. Un exemple est le récepteur de lectine de type C DEC-205, qui peut être ciblé par des anticorps spécifiques au DEC-205 pour induire une endocytose. Il est important de noter qu’il a été démontré que le ciblage DEC-205 en association avec des adjuvants appropriés induit efficacement des lymphocytes T CD4+ et CD8+ protecteurs à longue durée de vie et protecteurs, ainsi que des réponses d’anticorps, également contre les antigènes tumoraux3,5,6,7,8,9.
Il existe un certain nombre d’études montrant que les antigènes conjugués ciblés par DC sont supérieurs à l’antigène libre non conjugué3,5,10,11,12. Cela fait de la conjugaison de l’antigène à la fraction de ciblage DC respective une étape centrale dans les approches de ciblage DC. Dans le cas du ciblage DC via des anticorps ou des fragments d’anticorps, les antigènes peuvent être chimiquement ou génétiquement liés et l’une ou l’autre stratégie fournit ses propres (dés)avantages1. D’une part, dans les constructions anticorps-antigènes génétiquement modifiées, il existe un contrôle de la dose d’antigène ainsi que de l’emplacement offrant une comparabilité supérieure entre les lots1. Dans le même temps, cependant, la conjugaison chimique nécessite moins de préparation et offre plus de flexibilité, en particulier lorsqu’il s’agit de tester et de comparer différents antigènes et / ou stratégies de vaccination dans des modèles expérimentaux et précliniques.
Nous présentons ici un protocole pour la conjugaison chimique efficace et fiable de l’ovalbumine (OVA) en tant qu’antigène protéique modèle à un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) adapté au ciblage DC in vivo chez la souris. Tout d’abord, l’αDEC-205 est purifié à partir de cellules d’hybridome NLDC-14513. Pour la conjugaison chimique, le réticulant hétérobifonctionnel sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), qui contient des groupes ester NHS (N-hydroxysuccinimide) et maléimide, est utilisé, permettant la conjugaison covalente des molécules contenant des amines et des sulfhydryles. Plus précisément, les amines primaires de l’anticorps réagissent initialement avec le sulfo-SMCC et l’αDEC-205 activé par le maléimide qui en résulte réagit ensuite avec la protéine OVA contenant du sulfhydryle réduite par TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine de tris(2-carboxyéthyle)). Le produit final est chimiquement conjugué αDEC-205/OVA (Figure 1). Au-delà de la conjugaison chimique elle-même, notre protocole décrit l’élimination de l’excès d’OVA du conjugué ainsi que la vérification de la conjugaison réussie par une analyse par transfert western et un test immuno-enzymatique spécifique. Nous avons utilisé avec succès cette approche dans le passé pour conjuguer chimiquement l’OVA et d’autres protéines ou peptides immunogènes en αDEC-205. Nous démontrons une liaison efficace aux cellules CD11c+ in vitro ainsi que l’induction efficace de l’immunité cellulaire et humorale in vivo.
Certes, il y a des inconvénients à cette méthode, comme dans la comparabilité de lot à lot et dans le dosage exact de l’antigène dans le conjugué final. Néanmoins, la conjugaison chimique offre une flexibilité expérimentale dans le choix de l’anticorps et de l’antigène protéique par rapport aux constructions génétiquement modifiées. Par conséquent, nous pensons que cette approche est particulièrement utile pour évaluer différents antigènes pour leur efficacité dans le ciblage DC dans des modèles murins précliniques, et surtout dans le contexte de réponses immunitaires antitumorales spécifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La conjugaison chimique d’un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose et d’un antigène protéique fournit une approche efficace et, surtout, flexible pour le ciblage in vivo dc dans des modèles murins précliniques. Avec notre protocole, nous fournissons une approche efficace pour la conjugaison réussie de l’antigène modèle OVA à un anticorps IgG spécifique DEC-205.
Dans notre protocole, αDEC-205 est purifié à partir d’une lignée cellulaire d’hybridom…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient S. Prettin pour son assistance technique experte. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF) qui a été fournie dans le cadre de l’Alliance Helmholtz ”Immunothérapie des cancers” (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
Referencias
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