Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die chemische Konjugation des Modellantigens Ovalbumin zu einem endozytoserezeptorspezifischen Antikörper für das in vivo dendritische Zell-Targeting. Das Protokoll umfasst die Reinigung des Antikörpers, die chemische Konjugation des Antigens sowie die Reinigung des Konjugats und die Überprüfung der effizienten Konjugation.
Abstract
Die gezielte Antigenabgabe an kreuzproduzierende dendritische Zellen (DC) in vivo induziert effizient T-Effektorzellantworten und zeigt einen wertvollen Ansatz im Impfstoffdesign. Antigen wird über Antikörper, die spezifisch für Endozytoserezeptoren wie DEC-205 sind, die Aufnahme, Verarbeitung und MHC-Klasse-I- und II-Präsentation induzieren, an DC abgegeben.
Die effiziente und zuverlässige Konjugation des gewünschten Antigens zu einem geeigneten Antikörper ist ein kritischer Schritt im DC-Targeting und hängt unter anderem vom Format des Antigens ab. Die chemische Konjugation von Protein in voller Länge zu gereinigten Antikörpern ist eine mögliche Strategie. In der Vergangenheit haben wir erfolgreich eine Vernetzung des Modellantigens Ovalbumin (OVA) und eines DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörpers (αDEC-205) für In-vivo-DC-Targeting-Studien an Mäusen etabliert. Der erste Schritt des Protokolls ist die Reinigung des Antikörpers aus dem Überstand des NLDC(non-lymphoid dendritic cells)-145 Hybridoms durch Affinitätschromatographie. Der gereinigte Antikörper wird zur chemischen Konjugation durch Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat) aktiviert, während gleichzeitig die Sulfhydrylgruppen des OVA-Proteins durch Inkubation mit TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) exponiert werden. Überschüssiges TCEP-HCl und Sulfo-SMCC werden entfernt und das Antigen wird mit dem aktivierten Antikörper zur Übernachtkopplung gemischt. Das resultierende αDEC-205/OVA-Konjugat wird konzentriert und von ungebundener OVA befreit. Die erfolgreiche Konjugation von OVA zu αDEC-205 wird durch Western-Blot-Analyse und Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verifiziert.
Wir haben erfolgreich chemisch vernetztes αDEC-205/OVA verwendet, um zytotoxische T-Zell-Reaktionen in der Leber zu induzieren und verschiedene Adjuvantien auf ihr Potenzial bei der Induktion einer humoralen und zellulären Immunität nach in vivo Targeting von DEC-205+ DC zu vergleichen. Darüber hinaus bieten solche chemisch gekoppelten Antikörper/Antigen-Konjugate wertvolle Werkzeuge für die effiziente Induktion von Impfantworten auf Tumorantigene und haben sich hinsichtlich der Prävention und Therapie verschiedener Tumorarten als überlegen gegenüber klassischen Immunisierungsansätzen erwiesen.
Introduction
Dendritische Zellen (DC) sind zentrale Akteure des Immunsystems. Sie sind eine vielfältige Gruppe von Zellen, die auf die Antigenpräsentation spezialisiert sind, und ihre Hauptfunktion besteht darin, angeborene und adaptive Immunität zu überbrücken1,2. Wichtig ist, dass DC nicht nur eine wichtige Rolle bei effizienten und spezifischen pathogengesteuerten Reaktionen spielt, sondern auch an vielen Aspekten der Antitumorimmunität beteiligt ist1,3.
Aufgrund ihrer exklusiven Rolle bei der Wirtsimmunität rückte DC als Zielzellen für die Impfung in den Fokus4. Ein Ansatz besteht darin, Antigene in vivo auf DC auszurichten, um antigenspezifische Immunantworten zu induzieren, und in den letzten Jahren wurde eine große Anzahl von Studien der Definition geeigneter Rezeptoren und Targeting-Strategien gewidmet1,4. Ein Beispiel ist der C-Typ-Lektinrezeptor DEC-205, der durch DEC-205-spezifische Antikörper gezielt endozytose induziert werden kann. Wichtig ist, dass DEC-205-Targeting in Kombination mit geeigneten Adjuvantien nachweislich langlebige und schützende CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie Antikörperreaktionen auch gegen die Tumorantigene 3,5,6,7,8,9wirksam induziert.
Es gibt eine Reihe von Studien, die zeigen, dass konjugierte Antigene, die auf DC abzielen, dem freien unkonjugierten Antigen3,5,10,11,12überlegen sind. Dies macht die Konjugation des Antigens zur jeweiligen DC-Zieleinheit zu einem zentralen Schritt in DC-Targeting-Ansätzen. Im Falle des DC-Targetings über Antikörper oder Antikörperfragmente können Antigene entweder chemisch oder genetisch verknüpft sein, und jede Strategie bietet ihre eigenen (Dis-)Vorteile1. Auf der einen Seite gibt es in gentechnisch veränderten Antikörper-Antigen-Konstrukten eine Kontrolle über die Antigendosis sowie den Ort, der eine überlegene Vergleichbarkeit zwischen den Losen1 ermöglicht. Gleichzeitig benötigt die chemische Konjugation jedoch weniger Vorbereitung und bietet mehr Flexibilität, insbesondere wenn versucht wird, verschiedene Antigene und / oder Impfstrategien in experimentellen und präklinischen Modellen zu testen und zu vergleichen.
Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente und zuverlässige chemische Konjugation von Ovalbumin (OVA) als Modellproteinantigen zu einem DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörper (αDEC-205) vor, der für das in vivo DC-Targeting in Mäusen geeignet ist. Zunächst wird αDEC-205 aus NLDC-145-Hybridomzellen13gereinigt. Zur chemischen Konjugation wird der heterobifunktionelle Vernetzer Sulfosuccinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) verwendet, der NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Ester- und Maleimidgruppen enthält, was eine kovalente Konjugation von amin- und Sulfhydryl-haltigen Molekülen ermöglicht. Insbesondere reagieren die primären Amine des Antikörpers zunächst mit Sulfo-SMCC und das resultierende Maleimid-aktivierte αDEC-205 reagiert dann mit dem durch TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) reduzierten Sulfhydryl-haltigen OVA-Protein. Das Endprodukt ist chemisch konjugiert αDEC-205/OVA (Abbildung 1). Über die chemische Konjugation selbst hinaus beschreibt unser Protokoll die Entfernung überschüssiger OVA aus dem Konjugat sowie die Überprüfung der erfolgreichen Konjugation durch Western-Blot-Analyse und einen spezifischen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay. Wir haben diesen Ansatz in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um OVA und andere Proteine oder immunogene Peptide chemisch an αDEC-205 zu konjugieren. Wir demonstrieren eine effiziente Bindung an CD11c+ -Zellen in vitro sowie die effiziente Induktion der zellulären und humoralen Immunität in vivo.
Sicherlich gibt es Nachteile dieser Methode, wie z.B. in der Parierbarkeit von Charge zu Charge und bei der genauen Dosierung des Antigens innerhalb des endgültigen Konjugats. Dennoch bietet die chemische Konjugation experimentelle Flexibilität bei der Wahl des Antikörpers und des Proteinantigens im Vergleich zu gentechnisch veränderten Konstrukten. Daher glauben wir, dass dieser Ansatz besonders wertvoll ist, um verschiedene Antigene auf ihre Effizienz beim DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen zu bewerten, vor allem auch im Zusammenhang mit spezifischen Antitumor-Immunantworten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die chemische Konjugation eines endozytoserezeptorspezifischen Antikörpers und eines Proteinantigens bietet einen effizienten und vor allem flexiblen Ansatz für das In-vivo-DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen. Mit unserem Protokoll bieten wir einen effizienten Ansatz für die erfolgreiche Konjugation des Modellantigens OVA zu einem DEC-205-spezifischen IgG-Antikörper.
In unserem Protokoll wird αDEC-205 aus einer Hybridom-Zelllinie gereinigt und in der Vergangenheit haben w…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken S. Prettin für die fachkundige technische Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF), das im Rahmen der Helmholtz-Allianz “Immuntherapie von Krebserkrankungen” (HCC_WP2b) zur Verfügung gestellt wurde.
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
Referencias
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