Conjugación química de un anticuerpo purificado dirigido por DEC-205 con proteína de longitud completa para atacar células dendríticas de ratón in vitro e in vivo
Summary
Describimos un protocolo para la conjugación química del antígeno modelo ovoalbúmina a un anticuerpo específico del receptor de endocitosis para la orientación in vivo de células dendríticas. El protocolo incluye la purificación del anticuerpo, la conjugación química del antígeno, así como la purificación del conjugado y la verificación de una conjugación eficiente.
Abstract
La administración dirigida de antígenos a células dendríticas (CC) de presentación cruzada in vivo induce de manera eficiente las respuestas de las células efectoras T y muestra un enfoque valioso en el diseño de vacunas. El antígeno se administra a DC a través de anticuerpos específicos para los receptores de endocitosis como DEC-205 que inducen la absorción, el procesamiento y la presentación de MHC de clase I y II.
La conjugación eficiente y confiable del antígeno deseado a un anticuerpo adecuado es un paso crítico en la orientación de CC y, entre otros factores, depende del formato del antígeno. La conjugación química de proteína de longitud completa a anticuerpos purificados es una posible estrategia. En el pasado, hemos establecido con éxito la reticulación del antígeno modelo de ovoalbúmina (OVA) y un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) para estudios de orientación de CC in vivo en ratones. El primer paso del protocolo es la purificación del anticuerpo del sobrenadante del hibridoma NLDC (células dendríticas no linfoides)-145 por cromatografía de afinidad. El anticuerpo purificado se activa para la conjugación química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) mientras que al mismo tiempo los grupos sulfhidrilo de la proteína OVA se exponen a través de la incubación con TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina tris (2-carboxietilo)). El exceso de TCEP-HCl y sulfo-SMCC se eliminan y el antígeno se mezcla con el anticuerpo activado para el acoplamiento nocturno. El conjugado αDEC-205/OVA resultante se concentra y se libera del OVA no unido. La conjugación exitosa de OVA a αDEC-205 se verifica mediante el análisis de Western Blot y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Hemos utilizado con éxito αDEC-205/OVA reticulados químicamente para inducir respuestas citotóxicas de células T en el hígado y para comparar diferentes adyuvantes por su potencial en la inducción de inmunidad humoral y celular después de la orientación in vivo de DEC-205+ DC. Más allá de eso, tales conjugados anticuerpo/antígeno acoplados químicamente ofrecen herramientas valiosas para la inducción eficiente de las respuestas de la vacuna a los antígenos tumorales y se ha demostrado que son superiores a los enfoques clásicos de inmunización con respecto a la prevención y el tratamiento de varios tipos de tumores.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son actores centrales del sistema inmunitario. Son un grupo diverso de células especializadas en la presentación de antígenos y su función principal es tender puentes entre la inmunidad innata y adaptativa1,2. Es importante destacar que los DC no solo desempeñan un papel importante en respuestas eficientes y específicas dirigidas a patógenos, sino que también están involucrados en muchos aspectos de la inmunidad antitumoral1,3.
Debido a su papel exclusivo en la inmunidad del huésped, la DC se centró como células diana para la vacunación4. Un enfoque es dirigir antígenos a DC in vivo para inducir respuestas inmunes específicas de antígenos y en los últimos años, un gran número de estudios se han dedicado a definir receptores adecuados y estrategias de orientación1,4. Un ejemplo es el receptor de lectina de tipo C DEC-205, que puede ser dirigido por anticuerpos específicos de DEC-205 para inducir endocitosis. Es importante destacar que se ha demostrado que la orientación DEC-205 en combinación con adyuvantes adecuados induce de manera eficiente células T CD4+ y CD8+ de larga vida y protectoras, así como respuestas de anticuerpos, también contra antígenos tumorales3,5,6,7,8,9.
Hay una serie de estudios que muestran que los antígenos conjugados dirigidos a DC son superiores al antígeno libre no conjugado3,5,10,11,12. Esto hace que la conjugación del antígeno con la respectiva fracción de orientación de CC sea un paso central en los enfoques de orientación de CC. En el caso de la orientación de DC a través de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los antígenos pueden estar unidos química o genéticamente y cualquiera de las estrategias proporciona sus propias (des)ventajas1. Por un lado, en las construcciones de anticuerpos-antígenos genéticamente modificados existe un control sobre la dosis de antígenos, así como la ubicación que proporciona una comparabilidad superior entre los lotes1. Al mismo tiempo, sin embargo, la conjugación química necesita menos preparación y proporciona más flexibilidad, especialmente cuando se intenta probar y comparar diferentes antígenos y / o estrategias de vacunación en modelos experimentales y preclínicos.
Aquí, presentamos un protocolo para la conjugación química eficiente y confiable de la ovoalbúmina (OVA) como antígeno proteico modelo a un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) adecuado para la orientación de CC in vivo en ratones. En primer lugar, αDEC-205 se purifica a partir de células de hibridoma NLDC-14513. Para la conjugación química, se utiliza el reticulador heterobifuncional sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contiene éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y grupos maleimida, lo que permite la conjugación covalente de moléculas que contienen amina y sulfhidrilo. Específicamente, las aminas primarias del anticuerpo reaccionan inicialmente con sulfo-SMCC y la αDEC-205 activada por maleimida resultante y luego reaccionan con la proteína OVA que contiene sulfhidrilo reducida a través de TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina Tris(2-carboxietilo)). El producto final es αDEC-205/OVA conjugado químicamente (Figura 1). Más allá de la conjugación química en sí, nuestro protocolo describe la eliminación del exceso de OVA del conjugado, así como la verificación de la conjugación exitosa a través del análisis de Western Blot y un ensayo específico de inmunoabsorción ligado a enzimas. Hemos empleado con éxito este enfoque en el pasado para conjugar químicamente OVA y otras proteínas o péptidos inmunogénicos a αDEC-205. Demostramos la unión eficiente a células CD11c+ in vitro así como la inducción eficiente de inmunidad celular y humoral in vivo.
Ciertamente, hay inconvenientes en este método, como en la comparabilidad de lote a lote y en la dosificación exacta del antígeno dentro del conjugado final. Sin embargo, la conjugación química proporciona flexibilidad experimental en la elección del anticuerpo y el antígeno proteico en comparación con las construcciones genéticamente modificadas. Por lo tanto, creemos que este enfoque es especialmente valioso en la evaluación de diferentes antígenos por su eficiencia en la orientación de CC en modelos preclínicos de ratón, lo que es importante también en el contexto de respuestas inmunes antitumorales específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La conjugación química de un anticuerpo específico del receptor de endocitosis y un antígeno proteico proporciona un enfoque eficiente y, lo que es más importante, también flexible para la orientación in vivo de DC en modelos preclínicos de ratón. Con nuestro protocolo proporcionamos un enfoque eficiente para la conjugación exitosa del modelo de antígeno OVA a un anticuerpo IgG específico de DEC-205.
En nuestro protocolo, αDEC-205 se purifica a partir de una línea celula…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a S. Prettin la asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación Alemanes (HGF) que se proporcionó como parte de la Alianza Helmholtz “Inmunoterapia de Cánceres” (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
Referencias
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