Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel
Summary
Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.
Abstract
Het darmslijmvlies wordt bekleed door een enkele laag epitheelcellen die een dynamische barrière vormt die paracellulair transport van voedingsstoffen en water mogelijk maakt en tegelijkertijd de doorgang van luminale bacteriën en exogene stoffen voorkomt. Een breuk van deze laag resulteert in een verhoogde permeabiliteit van de luminale inhoud en rekrutering van immuuncellen, die beide kenmerken zijn van pathologische toestanden in de darm, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD).
Mechanismen die de epitheliale barrièrefunctie en transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) reguleren, worden onvolledig begrepen vanwege het gebrek aan experimentele in vivo methoden die kwantitatieve analyses mogelijk maken. Hier beschrijven we een robuust murien experimenteel model dat een exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt. De exteriorized intestinale lus (iLoop) is volledig gevasculariseerd en biedt fysiologische voordelen ten opzichte van ex vivo kamergebaseerde benaderingen die vaak worden gebruikt om permeabiliteit en PMN-migratie over epitheliale celmonolagen te bestuderen.
We demonstreren twee toepassingen van dit model in detail: (1) kwantitatieve meting van intestinale permeabiliteit door detectie van fluorescentie-gelabelde dextrans in serum na intraluminale injectie, (2) kwantitatieve beoordeling van gemigreerd PMN over het darmepitheel in het darmlumen na intraluminale introductie van chemoattractanten. We tonen de haalbaarheid van dit model aan en leveren resultaten met behulp van de iLoop bij muizen die het epitheliale strakke junction-geassocieerde eiwit JAM-A missen in vergelijking met controles. Van JAM-A is aangetoond dat het de epitheliale barrièrefunctie en PMN TEpM reguleert tijdens ontstekingsreacties. Onze resultaten met behulp van de iLoop bevestigen eerdere studies en benadrukken het belang van JAM-A bij de regulering van intestinale permeabiliteit en PMN TEpM in vivo tijdens homeostase en ziekte.
Het iLoop-model biedt een sterk gestandaardiseerde methode voor reproduceerbare in vivo studies van intestinale homeostase en ontsteking en zal het begrip van de darmbarrièrefunctie en mucosale ontsteking bij ziekten zoals IBD aanzienlijk verbeteren.
Introduction
Het darmslijmvlies omvat een enkele laag zuilvormige intestinale epitheelcellen (IECs), onderliggende lamina propria immuuncellen en het muscularis-slijmvlies. Naast zijn rol in de opname van voedingsstoffen, is het darmepitheel een fysieke barrière die het lichaamsinterieur beschermt tegen luminale commensale bacteriën, pathogenen en voedingsantigenen. Bovendien coördineren IECs en lamina propria immuuncellen de immuunrespons die tolerantie of respons induceert, afhankelijk van de context en stimuli. Er is gemeld dat de verstoring van de epitheliale barrière kan voorafgaan aan het begin van pathologische mucosale ontsteking en kan bijdragen aan inflammatoire darmziekte (IBD) die zowel colitis ulcerosa als de ziekte van Crohnomvat 1,2,3,4,5,6,7. Personen met colitis ulcerosa vertonen overmatige transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) die crypte abcessen vormen, een bevinding die is geassocieerd met de ernst van ziekte8,9. Hoewel gecompromitteerde epitheliale barrièrefunctie en overmatige immuunresponsen kenmerken van IBD zijn, is er een gebrek aan experimentele in vivo assays om kwantitatieve beoordelingen van intestinale permeabiliteit en immuuncelwerving in het darmslijmvlies uit te voeren.
De meest gebruikte methoden voor het bestuderen van intestinale epitheliale permeabiliteit en PMN TEpM maken gebruik van ex vivo kamergebaseerde benaderingen met behulp van IEC-monolagen gekweekt op semi-permeabele poreuze membraaninzetstukken10,11,12. De integriteit van de epitheelbarrière wordt gecontroleerd door metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) of de paracellulaire flux van het Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabelde dextran van apicaal naar basaalcompartiment 13,14,15. Evenzo wordt PMN TEpM meestal bestudeerd als reactie op een chemoattractant dat wordt toegevoegd in de onderste kamer16. PMN wordt in de bovenste kamer geplaatst en na een incubatieperiode wordt PMN dat naar het basale compartiment is gemigreerd verzameld en gekwantificeerd. Hoewel deze methoden nuttig, gemakkelijk uit te voeren en zeer reproduceerbaar zijn, zijn het duidelijk reductionistische benaderingen en vertegenwoordigen ze niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige weerspiegeling van in vivo omstandigheden.
Bij muizen is een veel voorkomende test om de intestinale paracellulaire permeabiliteit te bestuderen door orale gavage van FITC-dextran en daaropvolgende meting van fitc-dextran uiterlijk in het bloedserum13,17. Het nadeel van deze test is dat het een beoordeling is van de algehele barrière-integriteit van het maagdarmkanaal in plaats van die van regionale darmbijdragen. Bovendien wordt Evans blue vaak gebruikt om vasculaire lekkage in vivo18 te evalueren en is het ook gebruikt om de darmslijmvliesdoorlaatbaarheid bij muis en rat19,20,21te evalueren . De kwantificering van Evans blauw in het darmslijmvlies vereist extractie uit weefsel met behulp van incubatie in formamide ‘s nachts. Daarom kan hetzelfde weefsel niet worden gebruikt om intestinale epitheelpermeabiliteit en neutrofiele infiltratie te bestuderen.
Hier benadrukken we een eenvoudig protocol dat het aantal dieren vermindert dat nodig is om reproduceerbare gegevens te verzamelen over darmslijmvliespermeabiliteit en leukocyten transepitheliale migratie in vivo. Daarom raden we het gebruik van FITC-dextrans aan die gemakkelijk detecteerbaar zijn in bloedserum zonder de integriteit van darmlussen in gevaar te brengen die kunnen worden geoogst voor verdere analyse. Van belang is dat de intestinale ligated loops zijn gebruikt bij verschillende soorten (waaronder muis, rat, konijn, kalf) om bacteriële infecties (zoals Salmonella, Listeria monocytogenes en Escherichia coli)22,23,24,25 en intestinale permeabiliteit26te bestuderen; voor zover wij weten zijn er echter geen studies die mechanismen van PMN TEpM onderzoeken in specifieke regio’s in de darm zoals ileum of dikke darm die vaak betrokken zijn bij IBD.
Hier beschrijven we het muis intestinale lus (iLoop) model dat een robuuste en betrouwbare microchirurgische in vivo methode is die een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment van het ileum of proximale dikke darm gebruikt. Het iLoop-model is fysiologisch relevant en maakt de beoordeling van de integriteit van de darmbarrière en PMN TEpM op levende muizen onder narcose mogelijk. We demonstreren twee toepassingen: 1) kwantificering van serumspiegels van 4 kDa FITC-dextran na intraluminale toediening in de iLoop 2) kwantificering van getransmigreerd PMN in het iLoop lumen na intraluminale injectie van het krachtige chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Bovendien, het gebruik van het iLoop-model met Jam-a-null muizen of muizen die selectief verlies van JAM-A op IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) in vergelijking met controlemuizen, kunnen we eerdere studies bevestigen die een belangrijke bijdrage hebben gemeld voor nauw junction-geassocieerd eiwit JAM-A aan intestinale permeabiliteit en neutrofiele transmigratie15,28,29,30,31.
Het iLoop-model is een zeer functionele en fysiologische methode die kan worden gebruikt om in vitro assays te bevestigen. Bovendien is dit een veelzijdig experimenteel model dat de studie mogelijk maakt van verschillende reagentia die in het luslumen kunnen worden geïnjecteerd, waaronder chemokinen, cytokinen, bacteriële pathogenen, toxines, antilichamen en therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontregeling van de darmbarrièrefunctie en de rekrutering van immuuncellen onder pathologische aandoeningen zoals IBD worden onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een robuust in vivo murien model dat een goed gevasculariseerd exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt en het mogelijk maakt om de darmpermeabiliteit, neutrofiele migratiestudies en andere toepassingen te beoordelen.
De iLoop is een niet-hersteloperatie d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Dr. Sven Flemming van de Universiteit van Wuerzburg voor zijn bijdragen aan de totstandkoming van het proximale colon loop model, Sean Watson voor het beheer van de muizenkolonies en Chithra K. Muraleedharan voor het helpen bij de aanschaf van de foto’s van het iLoop model. Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) aan KB, R01DK079392, R01DK072564 en R01DK061379 aan C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
Referencias
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
