Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale
Summary
La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.
Abstract
La mucosa intestinale è rivestita da un singolo strato di cellule epiteliali che forma una barriera dinamica che consente il trasporto paracellulare di nutrienti e acqua prevenendo il passaggio di batteri luminali e sostanze esogene. Una violazione di questo strato si traduce in una maggiore permeabilità al contenuto luminare e al reclutamento di cellule immunitarie, entrambi tratti distintivi di stati patologici nell’intestino tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD).
I meccanismi che regolano la funzione di barriera epiteliale e la migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) sono incompleti compresi a causa della mancanza di metodi sperimentali in vivo che consentano analisi quantitative. Qui descriviamo un robusto modello sperimentale murino che impiega un segmento intestinale esteriore di ileo o colon prossimale. L’anello intestinale esternaizzato (iLoop) è completamente vascolarizzato e offre vantaggi fisiologici rispetto agli approcci basati su camera ex vivo comunemente usati per studiare la permeabilità e la migrazione della PMN attraverso monostrati di cellule epiteliali.
Dimostriamo in dettaglio due applicazioni di questo modello: (1) misurazione quantitativa della permeabilità intestinale attraverso il rilevamento di dextrans etichettato con fluorescenza nel siero dopo iniezione intraluminale, (2) valutazione quantitativa della PMN migrata attraverso l’epitelio intestinale nel lume intestinale dopo l’introduzione intraluminale di chemioattrattanti. Dimostriamo la fattibilità di questo modello e forniamo risultati utilizzando l’iLoop nei topi privi della proteina epiteliale associata alla giunzione stretta JAM-A rispetto ai controlli. JAM-A ha dimostrato di regolare la funzione barriera epiteliale così come il PMN TEpM durante le risposte infiammatorie. I nostri risultati utilizzando iLoop confermano studi precedenti ed evidenziano l’importanza del JAM-A nella regolazione della permeabilità intestinale e del PMN TEpM in vivo durante l’omeostasi e la malattia.
Il modello iLoop fornisce un metodo altamente standardizzato per studi in vivo riproducibili di omeostasi intestinale e infiammazione e migliorerà significativamente la comprensione della funzione barriera intestinale e dell’infiammazione della mucosa in malattie come l’IBD.
Introduction
La mucosa intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali intestinali colonnari (IHC), cellule immunitarie lamina propria sottostanti e mucose muscolose. Oltre al suo ruolo nell’assorbimento dei nutrienti, l’epitelio intestinale è una barriera fisica che protegge l’interno del corpo da batteri commensali luminali, agenti patogeni e antigeni dietetici. Inoltre, IEC e le cellule immunitarie lamina propria coordinano la risposta immunitaria inducendo tolleranza o risposta a seconda del contesto e degli stimoli. È stato riferito che l’interruzione della barriera epiteliale può precedere l’insorgenza di infiammazione della mucosa patologica e contribuire alla malattia infiammatoria intestinale (IBD) che comprende sia la colite ulcerosa che la malattia di Crohn1,2,3,4,5,6,7. Gli individui con colite ulcerosa presentano un’eccessiva migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) che formano ascessi di cripta, una scoperta che è stata associata alla gravitàdella malattia 8,9. Sebbene la funzione di barriera epiteliale compromessa e le risposte immunitarie eccessive siano segni distintivi dell’IBD, mancano test sperimentali in vivo per eseguire valutazioni quantitative della permeabilità intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie nella mucosa intestinale.
I metodi più comuni utilizzati per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e il PMN TEpM utilizzano approcci a camera ex vivo utilizzando monostrati IEC coltivati su inserti di membrana porosa semi-permeabile10,11,12. L’integrità della barriera epiteliale è monitorata da misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) o del flusso paracellulare dell’isotiocianato di fluoresceina (FITC) etichettato dextran dal compartimento apicale a quello basale13,14,15. Allo stesso modo, il PMN TEpM viene in genere studiato in risposta a un chemioattrattante che viene aggiunto nella camera inferiore16. Le PMN vengono poste nella camera superiore e dopo un periodo di incubazione, le PMN che sono migrate nel compartimento basale vengono raccolte e quantificate. Sebbene questi metodi siano utili, facili da eseguire e molto riproducibili, sono ovviamente approcci riduzionisti e non rappresentano necessariamente un riflesso accurato delle condizioni in vivo.
Nei topi, un saggio comune per studiare la permeabilità paracellulare intestinale è per gavage orale di FITC-dextran e successiva misurazione dell’aspetto FITC-dextran nel siero del sangue13,17. Lo svantaggio di questo saggio è che rappresenta una valutazione dell’integrità complessiva della barriera del tratto gastrointestinale piuttosto che quella dei contributi intestinali regionali. Inoltre, evans blue è comunemente usato per valutare la perdita vascolare in vivo18 ed è stato anche impiegato per valutare la permeabilità della mucosa intestinale nel topoe nel ratto 19,20,21. La quantificazione del blu Evans nella mucosa intestinale richiede l’estrazione dal tessuto impiegando incubazione in formamide durante la notte. Pertanto, lo stesso tessuto non può essere utilizzato per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e l’infiltrazione di neutrofili.
Qui evidenziamo un semplice protocollo che riduce il numero di animali necessari per raccogliere dati riproducibili sulla permeabilità della mucosa colonica e sulla migrazione transepiteliale dei leucociti in vivo. Raccomandiamo pertanto l’uso di FITC-dextrans facilmente rilevabili nel siero del sangue senza compromettere l’integrità dei loop intestinali che possono essere raccolti per ulteriori analisi. Da notare che gli anelli legati intestinali sono stati utilizzati in varie specie (tra cui topo, ratto, coniglio, vitello) per studiare l’infezione batterica (come Salmonella, Listeria monocytogenes ed Escherichia coli)22,23,24,25, nonché la permeabilità intestinale26; tuttavia, per quanto ne so non ci sono studi che studiano meccanismi di PMN TEpM in regioni specifiche nell’intestino come l’ileo o il colon che sono comunemente coinvolti nell’IBD.
Qui descriviamo il modello dell’anello intestinale del topo (iLoop) che è un metodo in vivo microchirurgico robusto e affidabile che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore del colon ileo o prossimale. Il modello iLoop è fisiologicamente rilevante e consente la valutazione dell’integrità della barriera intestinale e del TEpM PMN sui topi viventi in anestesia. Dimostriamo due applicazioni: 1) quantificazione dei livelli sieri di 4 kDa FITC-dextran dopo somministrazione intraluminale nell’iLoop 2) quantificazione della PMN trasmigrata nel lume iLoop dopo iniezione intraluminale della potente chemiotractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Inoltre, utilizzando il modello iLoop con topi o topi Jam-a-null che ospitano una perdita selettiva di JAM-A sugli IEC(Villin-cre; Jam-a fl/fl) rispetto ai topi di controllo, siamo in grado di confermare studi precedenti che hanno riportato un importante contributo per la proteina JAM-A associata alla giunzione stretta alla permeabilità intestinale e alla trasmigrazione neutrofila15,28,29,30,31.
Il modello iLoop è un metodo altamente funzionale e fisiologico che può essere utilizzato per confermare saggi in vitro. Inoltre, questo è un modello sperimentale versatile che consente lo studio di vari reagenti che possono essere iniettati nel lume loop, tra cui chemiochine, citochine, agenti patogeni batterici, tossine, anticorpi e terapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
I meccanismi responsabili della disregolazione della funzione barriera intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie in condizioni patologiche come l’IBD sono incompleti compresi. Qui, dettagliamo un robusto modello murino in vivo che utilizza un segmento intestinale esteriore ben vascolarizzato di ileo o colon prossimale e consente la valutazione della permeabilità intestinale, studi sulla migrazione dei neutrofili e altre applicazioni.
L’iLoop è un intervento chirurgico di non r…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Sven Flemming dell’Università di Wuerzburg per i suoi contributi alla creazione del modello a colon loop prossimale, Sean Watson per la gestione delle colonie di topi e Chithra K. Muraleedharan per aver contribuito all’acquisizione delle immagini del modello iLoop. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione tedesca per la ricerca/DFG (BO 5776/2-1) a KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 a C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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