Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

Summary

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Abstract

La muqueuse intestinale est tapée d’une seule couche de cellules épithéliales qui forme une barrière dynamique permettant le transport paracellulaire des nutriments et de l’eau tout en empêchant le passage des bactéries luminales et des substances exogènes. Une violation de cette couche entraîne une perméabilité accrue au contenu luminal et au recrutement de cellules immunitaires, qui sont les caractéristiques des états pathologiques dans l’intestin, y compris la maladie inflammatoire de l’intestin (MII).

Des mécanismes régulant la fonction épithéliale de barrière et la migration transepithelial (TEpM) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) sont insuffisamment compris en raison du manque de méthodes in vivo expérimentales permettant des analyses quantitatives. Ici, nous décrivons un modèle expérimental murin robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé de l’iléum ou des deux points proximaux. La boucle intestinale extériorisée (iLoop) est entièrement vascularisée et offre des avantages physiologiques par rapport aux approches ex vivo basées sur la chambre couramment utilisées pour étudier la perméabilité et la migration pmn à travers les monocouches de cellules épithéliales.

Nous démontrons deux applications de ce modèle en détail : (1) mesure quantitative de perméabilité intestinale par la détection de dextrans fluorescence-marqué dans le sérum après injection intraluminale, (2) évaluation quantitative de PMN émigré à travers l’épithélium intestinal dans le lumen d’intestin après introduction intraluminale des chemoattractants. Nous démontrons la faisabilité de ce modèle et fournissons des résultats en utilisant l’iLoop chez les souris dépourvues de la protéine JAM-A associée à la jonction serrée épithéliale par rapport aux contrôles. JAM-A a été montré pour réguler la fonction de barrière épithéliale aussi bien que PMN TEpM pendant des réponses inflammatoires. Nos résultats à l’aide de l’iLoop confirment les études précédentes et soulignent l’importance de JAM-A dans la régulation de la perméabilité intestinale et du PMN TEpM in vivo pendant l’homéostasie et la maladie.

Le modèle iLoop fournit une méthode hautement normalisée pour les études in vivo reproductibles de l’homéostasie intestinale et de l’inflammation et améliorera considérablement la compréhension de la fonction de barrière intestinale et de l’inflammation des muqueuses dans des maladies telles que les MII.

Introduction

La muqueuse intestinale englobe une seule couche de cellules épithéliales intestinales conaires (CSI), les cellules immunitaires sous-jacentes de propria de lame et les muqueuses musculaires. Outre son rôle dans l’absorption des nutriments, l’épithélium intestinal est une barrière physique qui protège l’intérieur du corps contre les bactéries commensales luminales, les agents pathogènes et les antigènes alimentaires. En outre, les cellules immunitaires IECs et propria de lame coordonnent la réponse immunitaire induisant la tolérance ou la réponse selon le contexte et les stimuli. Il a été rapporté que la perturbation de la barrière épithéliale peut précéder l’apparition de l’inflammation muqueuse pathologique et contribuer à la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) englobant à la fois la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn^{1,2,3,4,5,6,7.} Les individus atteints de colite ulcéreuse présentent une migration transépithéliale excessive (TEpM) de neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) formant des abcès de crypte, une conclusion qui a été associée à la gravité de la maladie^8,9. Bien que la fonction compromise de barrière épithéliale et les immuno-réactions excessives soient des caractéristiques de IBD, il y a un manque d’essais in vivo expérimentaux pour exécuter des évaluations quantitatives de la perméabilité intestinale et du recrutement de cellules immunitaires dans la muqueuse intestinale.

Les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et pmn TEpM emploient des approches ex vivo à base de chambre utilisant des monocouches IEC cultivées sur des inserts de membrane poreuse semi-perméables^10,11,12. L’intégrité de la barrière épithéliale est surveillée soit par des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER), soit par le flux paracellulaire du dextrane marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du compartiment apical au compartiment basal^13,14,15. De même, le PMN TEpM est typiquement étudié en réponse à un chimioattractant qui est ajouté dans la chambre basse^16. Les PMN sont placés dans la chambre haute et après une période d’incubation, les PMN qui ont migré dans le compartiment basal sont collectés et quantifiés. Bien que ces méthodes soient utiles, faciles à réaliser et très reproductibles, elles sont évidemment des approches réductionnistes et ne représentent pas nécessairement un reflet précis des conditions in vivo.

Chez la souris, un dosage courant pour étudier la perméabilité paracellulaire intestinale consiste à gavage oral de FITC-dextrane et mesure ultérieure de l’aspect FITC-dextrane dans le sérum sanguin^13,17. L’inconvénient de ce test est qu’il représente une évaluation de l’intégrité globale de la barrière du tractus gastro-intestinal plutôt que celle des contributions intestinales régionales. En outre, le bleu d’Evans est couramment utilisé pour évaluer les fuites vasculaires in vivo¹⁸ et a également été utilisé pour évaluer la perméabilité muqueuse intestinale chez la souris et le rat^19,20,21. La quantification du bleu d’Evans dans la muqueuse intestinale nécessite une extraction à partir de tissus utilisant l’incubation dans le formamide pendant la nuit. Par conséquent, le même tissu ne peut pas être employé pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et l’infiltration de neutrophile.

Ici nous mettons en évidence un protocole simple qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour collecter des données reproductibles sur la perméabilité muqueuse du côlon et la migration transepithelial de leucocyte in vivo. Nous recommandons donc l’utilisation de FITC-dextrans qui sont facilement discernables dans le sérum sanguin sans compromettre l’intégrité des boucles intestinales qui peuvent être récoltées pour davantage d’analyse. A noter, les boucles ligatures intestinales ont été utilisées chez diverses espèces (dont la souris, le rat, le lapin, le veau) pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, Listeria monocytogenes et Escherichiacoli)22,^23,24,25 ainsi que la perméabilité intestinale²⁶; cependant, au meilleur de notre connaissance il n’y a aucune étude étudiant des mécanismes de PMN TEpM dans des régions spécifiques dans l’intestin telles que l’iléon ou les deux points qui sont généralement impliqués dans IBD.

Ici nous décrivons le modèle intestinal de boucle intestinale de souris (iLoop) qui est une méthode in vivo microchirurgical robuste et fiable qui emploie un segment intestinal bien-vascularisé et extériorisé de l’iléon ou des deux points proximaux. Le modèle iLoop est physiologiquement pertinent et permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et le PMN TEpM sur des souris vivantes sous anesthésie. Nous démontrons deux applications : 1) quantification des niveaux sériques de 4 kDa FITC-dextrane après administration intraluminale dans l’iLoop 2) quantification de PMN transmigré dans l’iLoop lumen après injection intraluminale du puissant chemottractant Leukotriene_B4 (LTB₄₎^27. De plus, en utilisant le modèle iLoop avec des souris Jam-a-nullou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a ^fl/fl)par rapport aux souris témoins, nous sommes en mesure de corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution majeure pour la protéine JAM-A associée à la jonction serrée à la perméabilité intestinale et à la transmigration des neutrophiles^{15,28,29,30,31.}

Le modèle iLoop est une méthode hautement fonctionnelle et physiologique qui peut être utilisée pour corroborer les essais in vitro. En outre, il s’agit d’un modèle expérimental polyvalent qui permet l’étude de divers réactifs qui peuvent être injectés dans la lumière de l’anse, y compris les chimiokines, les cytokines, les agents pathogènes bactériens, les toxines, les anticorps et les thérapeutiques.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices et aux politiques des National Institutes of Health et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. 1. Préparation préopératoire REMARQUE: Cette méthode a été générée en utilisant des souris adultes issues de l’expérience génétique C57BL/6, âgées de 8 à 12 semaines. Toutes les souris o…

Representative Results

Une représentation schématique des modèles de boucle iléale et de pcLoop est représentée à la figure 1 et à la figure 2,respectivement. Les images anatomiques montrent les étapes critiques de la procédure, y compris l’extériorisation du segment intestinal(figure 1B et figure 2B),l’identification d’un emplacement approprié pour les ligatures qui permet une perturbation …

Discussion

Les mécanismes responsables du dysregulation de la fonction intestinale de barrière et du recrutement de cellules immunitaires dans des conditions pathologiques telles que IBD sont incomplètement compris. Ici, nous détaillons un modèle murin in vivo robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé bien vascularisé de l’iléon ou du côlon proximal et permet l’évaluation de la perméabilité intestinale, des études de migration des neutrophiles ainsi que d’autres applications.

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Materials

Equipment and Material
BD Alcohol Swabs	BD	326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"	BD	305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle	BD	309659
15ml Centrifuge Tube	Corning	14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate	FisherScientific	07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape	FisherScientific	15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)	FST	12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)	FisherScientific	06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes	Thomas Scientific	c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)	Sarstedt	41.1501.105
Moria Fine Scissors	FST	14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)	Falcon	352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant	Dechra	12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)	FST	1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting	HenrySchein	SS694
Student Fine Forceps, Angled	FST	91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z248029
96 Well Cell Culture Plate	Corning	3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	BioWhittaker	10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution	Corning	21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)	BioLegend	127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen	C36950
Dithiotreitol	FisherScientific	BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	R&D Systems	511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000	Sigma	60842-46-8
Isoflurane	Halocarbon	12164-002-25
Leukotriene B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)	BD Pharmingen	557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)	BD Bioscience	553142
Recombinant Murine IFN-γ	Peprotech	315-05
Recombinant Murine TNF-α	Peprotech	315-01A