在维沃 小鼠头骨骨髓中巨细胞和前列腺的双光子成像
Summary
我们在这里描述了使用双光子显微镜对活鼠头骨骨髓中的巨细胞和前列腺进行成像的方法。
Abstract
血小板由位于骨髓中的特制细胞巨细胞产生。10多年前，对巨型卡约细胞及其原生环境进行实时成像的可能性进行了描述，为血小板的形成过程揭示了新的认识。巨细胞通过鼻窦状血管的内皮衬里延伸拉长突起，称为凸起。本文提出了一个协议，以实时荧光标记的巨型细胞在头骨骨髓和鼻窦血管中同时成像。这项技术依赖于一个小手术，保持头骨完好无损，以限制炎症反应。鼠标头固定在头骨上，以防止呼吸。
使用双光子显微镜，巨型卡约细胞可以可视化长达几个小时，从而能够观察鼻窦血管内拉长过程中的细胞突起和凸起。这允许量化与突起形态（宽度、长度、收缩区域的存在）及其伸长行为（速度、规律性或暂停或缩回相的存在）相关的几个参数。该技术还允许同时记录鼻窦血管中的循环血小板，以确定血小板的速度和血流方向。这种方法对于研究使用转基因小鼠在血小板形成中感兴趣的基因的作用特别有用，并且也适用于药理学测试（研究机制，评估药物在治疗血小板生产障碍中的作用）。它已成为一个宝贵的工具，特别是补充 体外 研究，因为它现在知道， 在体内 和 体外 前列板形成依赖于不同的机制。例如，已经表明， 体外 显微管本身需要前列板拉长。然而， 在体内，他们宁愿作为一个脚手架，拉长主要是由血液流动的力量促进。
Introduction
血小板由位于骨髓中的巨型细胞专用细胞产生。由于通过骨骼观察实时事件的技术挑战，巨细胞在血液循环中释放血小板的确切方式长期以来一直不清楚。双光子显微镜帮助克服了这一挑战，并在了解血小板形成过程方面取得了重大进展。2007年，冯·安德里亚和他的同事首次 在体内 进行了巨型卡约细胞观测，通过头骨1对荧光巨细胞进行了可视化。这是可能的，因为年轻成年小鼠前体头骨的骨层厚度为几十微米，并且足够透明，能够对基础骨髓2中的荧光细胞进行可视化。
随后的研究应用了这一程序来评估在各种条件下的前列板形成，并破译了基础机制3，4，5，6。这些研究提供了确凿的证据，证明巨细胞通过鼻窦血管的内皮屏障动态延伸突起（图1）。然后，这些蛋白胎作为代表数百个血小板体积的长片段被释放。血小板将在下游器官的微循环中，特别是肺部的导板进行改造后形成。然而，迄今为止，确切的过程和分子机制仍有待讨论。例如，细胞骨骼蛋白在前列板拉长中的作用在体外条件和体内条件3之间有所不同，在炎症条件下，前列板形成的差异已经显现出来。使事情更加复杂的是，最近的一项研究对前列腺驱动的概念提出异议，并建议在体内，血小板基本上是通过在8级巨细胞的膜萌芽机制形成的。
本文采用微创程序，从活鼠的头骨骨中观察骨髓中的巨型细胞和前列腺。类似的方法以前曾被描述为可视化其他骨髓细胞，特别是造血干细胞和祖细胞9。这里的重点是观察巨型卡约细胞和血小板，以详细说明一些可以测量的参数，特别是前列腺形态和血小板速度。此协议介绍了如何将导管插入壶静脉，以注射荧光示踪剂和药物，并通过头骨进行观察。钙变骨通过小手术暴露，使环粘在骨头上。此环用于固定头部并防止因呼吸而移动，并形成一个装满盐水的杯子，作为镜头的浸入介质。该技术非常适合 i） 实时观察正弦几何和与容器壁相互作用的巨型细胞：ii） 在前列腺形成、拉长和释放过程中遵循巨型卡约细胞：和 iii） 测量血小板运动，以监测复杂的鼻窦血流。使用此协议获得的数据最近已发布3。
Protocol
Representative Results
Discussion
血小板形成机制高度依赖骨髓环境。因此，活体显微镜已成为该领域实时可视化过程的重要工具。含有荧光巨细胞的小鼠可以通过与任何含有有条件荧光基因表达盒的浮子小鼠在巨型卡约细胞中表达Cre重组的小鼠进行交叉来获得。在这里，mTmG记者小鼠使用（B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）luo10）与Pf4-cre小鼠11交叉，允许强烈的绿色荧光标签在巨型卡…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢弗洛里安·盖尔特纳（奥地利克洛斯特纽堡科学技术研究所）在我们实验室建立这项技术时对双光子显微镜实验的专家建议，以及图像中心的伊夫·卢茨（法国伊尔基尔奇）的专业知识和帮助。我们还感谢让-伊夫·林克尔的技术帮助和伊内斯·吉纳德在图1中绘制的图式。我们感谢ARMESA（美德辛和桑特普利克的复明协会）在收购双光子显微镜方面给予的支持。AB得到了法国埃塔布利斯·杜桑（2016年PR）和国家拉雷切通讯社（ANR-18-CE14-0037-01）的博士后研究金的支持。
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
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