В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши
Summary
Здесь описан метод визуализации мегакариоцитов и проплацетов в костном мозге черепа живых мышей с помощью двухфотонной микроскопии.
Abstract
Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами, специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Возможность изображения мегакариоцитов в режиме реального времени и их родной среды была описана более 10 лет назад и проливает новый свет на процесс образования тромбоцитов. Мегакариоциты распространяются на удлиненные протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальную выстилку синусоидальных сосудов. В данной работе представлен протокол для одновременного изображения в режиме реального времени флуоресцентно меченых мегакариоцитов в костном мозге черепа и синусоидальных сосудах. Этот метод основан на незначительной операции, которая сохраняет череп нетронутым, чтобы ограничить воспалительные реакции. Голова мыши обездвижена кольцом, приклеенным к черепу, чтобы предотвратить движения от дыхания.
С помощью двухфотонной микроскопии мегакариоциты можно визуализировать на срок до нескольких часов, что позволяет наблюдать клеточные протрузии и проplatelets в процессе удлинения внутри синусоидальных сосудов. Это позволяет количественно оценить несколько параметров, связанных с морфологией выступов (ширина, длина, наличие сужающих областей) и их поведением удлинения (скорость, регулярность или наличие пауз или фаз втягивания). Этот метод также позволяет одновременно регистрировать циркулирующие тромбоциты в синусоидальных сосудах для определения скорости тромбоцитов и направления кровотока. Этот метод особенно полезен для изучения роли генов, представляющих интерес, в образовании тромбоцитов с использованием генетически модифицированных мышей, а также поддался фармакологической проверке (изучению механизмов, оценке препаратов при лечении нарушений выработки тромбоцитов). Он стал бесценным инструментом, особенно для дополнения исследований in vitro, поскольку теперь известно, что образование проплатлетов in vivo и in vitro зависит от разных механизмов. Было показано, например, что микротрубочки in vitro необходимы для удлинения проплатлетов как такового. Однако in vivoони скорее служат каркасом, удлинению которого в основном способствуют силы кровотока.
Introduction
Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами – специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Точный способ высвобождения мегакариоцитами тромбоцитов в циркуляции долгое время оставался неясным из-за технической проблемы в наблюдении событий в реальном времени через кость. Двухфотонная микроскопия помогла преодолеть эту проблему и привела к значительным достижениям в понимании процесса образования тромбоцитов. Первые наблюдения in vivo мегакариоцитов были сделаны фон Андрианом и его коллегами в 2007 году с визуализацией флуоресцентных мегакариоцитов через череп1. Это стало возможным благодаря тому, что костный слой в лобно-париетальном черепе молодых взрослых мышей имеет толщину в несколько десятков микрон и достаточно прозрачен, чтобы позволить визуализацию флуоресцентных клеток в нижележащего костном мозге2.
Последующие исследования применяли эту процедуру для оценки образования проплацирования в различных условиях и для расшифровки основных механизмов3,4,5,6. Эти исследования предоставили окончательные доказательства того, что мегакариоциты динамически расширяют протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальный барьер синусоидальных сосудов(рисунок 1). Эти пластинки затем высвобождаются в виде длинных фрагментов, которые представляют собой несколько сотен тромбоцитов в объеме. Тромбоциты будут образовываться после ремоделирования проплацетов в микроциркуляции нижестоящих органов, особенно в легких7. Однако на сегодняшний день точный процесс и молекулярные механизмы остаются предметом дискуссий. Например, предложенная роль цитоскелетных белков в удлинении проплацет различается между условиями in vitro и in vivo 3,и различия в образовании проплацелетов были продемонстрированы в воспалительных состояниях6. Еще больше усложняет ситуацию недавнее исследование, оспаривающее концепцию, управляемую проплатлетами, и предположило, что in vivoтромбоциты по существу образуются через механизм мембранного почкования на уровне мегакариоцитов8.
В данной работе представлен протокол наблюдения за мегакариоцитами и проплацелетами в костном мозге из кости черепа у живых мышей, с использованием малоинвазивной процедуры. Подобные подходы были ранее описаны для визуализации других клеток костного мозга, в частности гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток9. Основное внимание здесь уделяется наблюдению за мегакариоцитами и тромбоцитами для детализации некоторых параметров, которые могут быть измерены, в частности морфологии проплатлетов и скорости тромбоцитов. В этом протоколе представлено, как вставить катетер в яремную вену для введения флуоресцентных индикаторов и лекарств и наблюдения через кость черепа. Кальвариальная кость подвергается воздействию с помощью незначительной хирургии, так что кольцо приклеивается к кости. Это кольцо служит для обездвиживания головы и предотвращения движений из-за дыхания и образует чашку, наполненную физиологическим раствором в качестве погружной среды хрусталика. Эта методика хорошо подходит для i) наблюдения в режиме реального времени синусоидальной геометрии и мегакариоцитов, взаимодействующих со стенкой сосуда; ii) следить за мегакариоцитами в процессе образования, удлинения и высвобождения проплацирования; и iii) измерять движения тромбоцитов для мониторинга сложного синусоидального кровотока. Данные, полученные с помощью этого протокола, были недавно опубликованы3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Механизмы образования тромбоцитов сильно зависят от среды костного мозга. Следовательно, прижизальная микроскопия стала важным инструментом в полевых условиях для визуализации процесса в режиме реального времени. Мыши с флуоресцентными мегакариоцитами могут быть получены путем скр…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Флориана Гертнера (Институт науки и техники Австрии, Клостернойбург, Австрия) за его экспертные советы по экспериментам с двухфотонной микроскопией в то время, когда мы установили технику в лаборатории, и Ива Лутца в Центре визуализации IGBMC / CBI (Илькирх, Франция) за его опыт и помощь с двухфотонным микроскопом. Мы также благодарим Жана-Ива Ринкеля за его техническую помощь и Инес Гинард за рисование схемы на рисунке 1. Мы благодарим ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) за поддержку в приобретении двухфотонного микроскопа. AB был поддержан постдокторскими стипендиями от Etablissement Français du Sang (APR2016) и от Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Referencias
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
