ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר
Summary
אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
Abstract
טסיות מיוצרות על ידי megakaryocytes, תאים מיוחדים הממוקמים במח העצם. האפשרות לדמיין megakaryocytes בזמן אמת ואת הסביבה הטבעית שלהם תוארה לפני יותר מ -10 שנים ושופכת אור חדש על תהליך היווצרות טסיות הדם. Megakaryocytes להאריך בליטות מוארכות, הנקראות proplatelets, דרך רירית אנדותל של כלי סינוסואיד. מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה בו זמנית בזמן אמת שכותרתו מגהקריוציטים במח העצם של הגולגולת ובכלי הסינוסואידים. טכניקה זו מסתמכת על ניתוח קטן השומר על הגולגולת שלמה כדי להגביל את התגובות הדלקתיות. ראש העכבר משותק עם טבעת המודבקת לגולגולת כדי למנוע מתנועות לנשום.
באמצעות מיקרוסקופיה דו פוטונית, ניתן לדמיין מגהקריוציטים עד כמה שעות, ומאפשר תצפית של בליטות תאים והתפשטות בתהליך התארכות בתוך כלי הסינוסואידים. זה מאפשר כימות של מספר פרמטרים הקשורים למורפולוגיה של בליטות (רוחב, אורך, נוכחות של אזורי התכווצות) והתנהגות התארכותם (מהירות, סדירות או נוכחות של הפסקות או שלבי נסיגה). טכניקה זו מאפשרת גם הקלטה סימולטנית של טסיות דם במחזור בכלי הסינוסואידים כדי לקבוע את מהירות טסיות הדם ואת כיוון זרימת הדם. שיטה זו שימושית במיוחד כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהיווצרות טסיות דם באמצעות עכברים מהונדסים גנטית והיא גם נוחה לבדיקות פרמקולוגיות (חקר המנגנונים, הערכת תרופות בטיפול בהפרעות ייצור טסיות דם). זה הפך להיות כלי לא יסולא בפז, במיוחד כדי להשלים את המחקרים במבחנה כפי שהוא ידוע כיום כי היווצרות vivo ו אין ויטרו proplatelet להסתמך על מנגנונים שונים. הוכח, למשל, כי מיקרוטובולות במבחנה נדרשות להתארכות פרופלטלט כשלעצמה. עם זאת, ב vivo, הם מעדיפים לשמש פיגום, התארכות להיות מקודם בעיקר על ידי כוחות זרימת הדם.
Introduction
טסיות דם מיוצרות על ידי תאים מיוחדים megakaryocytes הממוקם במח העצם. הדרך המדויקת שבה מגהקריוציטים משחררים טסיות דם במחזור כבר מזמן לא ברורה בשל האתגר הטכני בהתבוננות באירועים בזמן אמת דרך העצם. מיקרוסקופיה דו-פוטונית סייעה להתגבר על אתגר זה והובילה להתקדמות משמעותית בהבנת תהליך היווצרות טסיות הדם. התצפיות הראשונות ב- vivo megakaryocyte נעשו על ידי פון אנדריאן ועמיתיו בשנת 2007, עם הדמיה של מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים דרך הגולגולת1. זה היה אפשרי כי שכבת העצם בגולגולת הקדמית של עכברים צעירים יש עובי של כמה עשרות מיקרון והוא שקוף מספיק כדי לאפשר הדמיה של תאים פלואורסצנטיים במח העצם הבסיסי2.
מחקרים שלאחר מכן יישמו הליך זה כדי להעריך היווצרות proplatelet בתנאים שונים ולפענח את המנגנונים הבסיסיים3,4,5,6. מחקרים אלה סיפקו ראיות חותכות לכך שמקריוציטים מרחפים באופן דינמי בליטות, הנקראות מפיץ, דרך המחסום האנדיותל של כלי הסינוסואידים (איור 1). מרחיבים אלה משתחררים לאחר מכן כמו שברים ארוכים המייצגים כמה מאות טסיות בנפח. טסיות הדם ייווצרו לאחר שיפוץ של ההתפשטות במיקרו-מחזור של איברים במורד הזרם, במיוחד בריאות7. עם זאת, עד כה, התהליך המדויק והמנגנונים המולקולריים עדיין נתונים לדיון. לדוגמה, התפקיד המוצע של חלבונים שלד ציטו בהארכת פרופלטלטים שונה בין במבחנה לבין in vivo תנאים3, והבדלים בהיווצרות פרופלטלט הוכחו בתנאים דלקתיים6. מסבך את הדברים עוד יותר, מחקר שנערך לאחרונה ערער על הרעיון מונע פרופלטלט והציע כי ב vivo, טסיות נוצרות למעשה באמצעות מנגנון ניצני ממברנה ברמה megakaryocyte8.
מאמר זה מציג פרוטוקול לתצפית של megakaryocytes ו proplatelets במח העצם מעצם הגולגולת בעכברים חיים, באמצעות הליך זעיר פולשני. גישות דומות תוארו בעבר כדי לדמיין תאי מח עצם אחרים, במיוחד גזע hematopoietic ותאי אבות9. ההתמקדות כאן היא על תצפית של megakaryocytes וטסיות כדי לפרט כמה פרמטרים שניתן למדוד, במיוחד מורפולוגיות proplate ומהירות טסיות דם. פרוטוקול זה מציג כיצד להכניס קטטר לתוך הווריד הצווארי כדי להזריק מעקבים פלואורסצנטיים וסמים ולהתבונן דרך עצם הגולגולת. עצם השוק חשוף באמצעות ניתוח קטין, כך טבעת מודבקת לעצם. טבעת זו משמשת כדי לשתק את הראש ולמנוע תנועות עקב נשימה וליצור מלאה מלוחים כאמצעי טבילה של העדשה. טכניקה זו מתאימה היטב i) להתבונן בזמן אמת גיאומטריה סינוסואידי megakaryocytes אינטראקציה עם קיר כלי; ii) לעקוב אחר megakaryocytes בתהליך של היווצרות proplatelet, התארכות, ושחרור; ו- iii) למדוד תנועות טסיות דם כדי לפקח על זרימת הדם הסינוסואידית המורכבת. נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו לאחרונה3.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנונים של היווצרות טסיות דם תלויים מאוד בסביבת מח העצם. לפיכך, מיקרוסקופיה תוך-וינטלית הפכה לכלי חשוב בתחום כדי לדמיין את התהליך בזמן אמת. עכברים עם מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים ניתן להשיג על ידי חציית עכברים המבטאים את Cre רקומבינאז במגקריוציטים עם כל עכברי כתב פלוקס המכילים קלטת ביטוי …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפלוריאן גרטנר (המכון למדע וטכנולוגיה אוסטריה, קלוסטרניובורג, אוסטריה) על עצתו המומחית לניסויי מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזמן שהקמנו את הטכניקה במעבדה, ולאיב לוץ במרכז ההדמיה IGBMC / CBI (אילקירך, צרפת) על מומחיותו ועזרתו במיקרוסקופ הדו-פוטון. אנו מודים גם לז’אן-איב רינקל על עזרתו הטכנית ולאינס גינארד על ציור הסכימה באיור 1. אנו מודים ל- ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) על תמיכתה ברכישת המיקרוסקופ הדו-פוטון. AB נתמך על ידי מלגות פוסט-דוקטורט מ- Etablissement Français du Sang (APR2016) ומ- Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).
Materials
| GNU Octave software | GNU Project | https://www.gnu.org/software/octave/ | |
| Histoacryl 5 x 0, 5 mL | Braun | 1050052 | injectable solution of surgical glue |
| HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes | Leica Microsystems | ||
| ImageJ | GNU project | Minimum version required | |
| Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL | Boehring | 03661103003199 | eye protection |
| Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 | Leica Microsystems | simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655 | |
| Matlab | MathWorks | https://www.mathworks.com/ | |
| Ocrygel 10 g | Laboratoires T.V.M. | 03700454505621 | Silicon dental paste blue and yellow |
| Picodent twinsin speed | Rotec | 13001002 | |
| Qtracker 655 vascular label | Invitrogen | Q21021MP | injectable solution |
| Resonant scanner, 8 or 12 kHz | |||
| Rompun Xylazine 2% fl/25 mL | Bayer | 04007221032311 | |
| Superglue gel | to glue the ring to the bone | ||
| Surflo IV catheter – Blue 22 G | Terumo | SR-OX2225C1 | |
| Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) | Coherent |
Referencias
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
- Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
- Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
- Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
- Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
- Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
- Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
- Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
- Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
- Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).
