使用光纤共聚焦激光微内窥镜检查的眼部药物输送系统的时空 体内 成像
Summary
我们提出了一种使用光纤共聚焦激光微内窥镜（CLM）的方案，以非侵入性地研究结膜下注射后眼睛中脂质体的时空分布。
Abstract
结膜下注射是一种有吸引力的眼部药物给药途径，因为它易于经巩膜通路，可绕过前眼屏障，如角膜和结膜。虽然一些研究已经描述了结膜下注射时药物的治疗效果和药代动力学，但很少有人评估药物或药物输送系统（DDS）的眼部分布。后者对于优化眼内DDS设计和药物生物利用度以实现所需的眼部定位和作用持续时间（例如，急性与延长）至关重要。本研究建立了使用光纤共聚焦激光微内窥镜（CLM）来定性地研究结膜下注射后活体中荧光脂质体的眼部分布。这是为微观层面的 体内 组织目视检查而设计的，这也是对CLM成像方法的首次完整描述，以研究结膜下注射后注射剂在眼睛中的时空分布。
Introduction
血液清除率，组织分布和药物在生命系统中的目标占用是了解 体内 药物处置的支柱。在临床前动物模型中，这些参数通常通过在药物给药后的特定时间点频繁的血液和组织采样来评估。然而，这些程序通常是侵入性的，通常包括非生存测量，并且需要大型动物队列进行统计。可能会产生额外的成本和时间，以及过度使用动物的道德问题。因此，非侵入性成像正迅速成为生物分布研究中不可或缺的一步。共聚焦激光微内窥镜检查（CLM1，2）非常适合眼部应用，以高灵敏度和高分辨率对活体动物眼中治疗药物的时空分布进行非侵入性成像1，3，4。
CLM有可能在全面定量DDS和药物生物利用度之前促进对眼部药物递送系统（DDS）（如脂质体）的稳健筛选。脂质体因其在调整其物理化学和生物物理性质5，6，7，8，9，10，11以封装各种治疗货物和控制药物释放的组织部位和作用持续时间方面的灵活性而具有吸引力。脂质体已用于眼部应用中的大分子递送，例如单克隆抗体贝伐珠单抗12，以及小分子如环孢菌素13和更昔洛韦14。与非脂质体”游离药物”制剂相比，药物负载的脂质体具有更长的生物学半衰期和更长的治疗效果。然而，眼组织中的药物分布通常由眼睛液体成分（即血液、房水和玻璃体房）中的药物浓度推断15，16，17。由于装载的药物货物的初始体内命运由纳米载体本身的性质定义，因此荧光脂质体的CLM成像可以作为药物的替代物，以揭示组织靶向和原位组织停留时间。此外，使用CLM递送的视觉证据可以指导DDS的重新设计，评估药物的治疗益处，甚至可能预测不良生物事件（例如，由于DDS长时间不期望定位而导致的组织毒性）。
本文详细介绍了如何研究具有双波段CLM系统的活小鼠中脂质体的眼部生物分布的分步程序。这种特定的CLM系统可以实时检测双色荧光（在488 nm和660 nm处使用绿色和红色激发激光器），频率为8帧/秒。通过将检测探针物理放置在眼睛上，该协议演示了在用2%Evans Blue（EB）染料预先注射（IV）的小鼠结膜下给药时对绿色荧光脂质体的图像采集和分析。EB染料有助于可视化红色荧光通道中的血管化结构。我们展示了一项研究的代表性结果，该研究评估了由磷脂POPC（即1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱）组成的100nm中性脂质体，并掺杂荧光素标记的磷脂Fl-DHPE（即 N-（荧光素-5-硫代氨基甲酰基）-1，2-二己基癸酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺）的比例为95%POPC：5%Fl-DHPE（图1B).CLM能够通过划定EB染色的眼组织边界，以15μm轴向和3.30μm横向分辨率捕获绿色荧光素标记的脂质体。
Protocol
Representative Results
Discussion
从结果中可以看出，CLM提供了一种简单可行的方法来成像眼睛中脂质体的眼部分布。我们之前已经证明使用CLM来表征小鼠眼内各种脂质体制剂随时间推移的定位1。对于非侵入性应用，CLM允许对前眼表面进行实时成像，以深入了解同一动物的脂质体在眼睛中的分布情况。这使得CLM适合在更全面的定量之前预先筛选纳米载体/ DDS。鉴于各种DDS的独特物理化学性质，通过常规组织学表?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由NTU-西北纳米医学研究所（NNIN）资助（授予SV），部分由新加坡国家研究基金会拨款AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013 / 2和新加坡健康与生物医学科学（HBMS）行业对齐基金预定位（IAF-PP）拨款H18 / 01 / a0 / 018由科学，技术和研究机构（A * STAR）管理（向AMC）。感谢杜克-新加坡国立大学转化与分子成像实验室（LTMI）的成员为设备研究和培训的后勤和执行提供了便利。特别感谢维斯娜·诺维拉女士的编辑协助。
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
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