Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi
Summary
Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Subkonjonktival enjeksiyon, kornea ve konjonktiva gibi ön oküler bariyerleri atlayan kolay trans-skleral erişim nedeniyle oküler ilaçları uygulamak için çekici bir yoldur. Subkonjonktival enjeksiyon üzerine ilaçların terapötik etkileri ve farmakokinetiği bazı çalışmalarda tanımlanmış olmakla birlikte, çok azı ilaçların veya ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) oküler dağılımını değerlendirmemektedir. İkincisi, istenen oküler lokalizasyonu ve etki süresini (örneğin, akut ve uzun süreli) elde etmek için göz içi DDS tasarımının ve ilaç biyoyararlanımının optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu çalışma, floresan lipozomların konjonktival enjeksiyondan sonra canlı farelerde gerçek zamanlı olarak oküler dağılımını niteliksel olarak incelemek için fiberoptik konfokal lazer mikroendoskopi (CLM) kullanımını ortaya çıkarmaktadır. Mikroskobik düzeyde dokuların in vivo görsel muayenesi için tasarlanan bu, aynı zamanda subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki enjekte edilebilirlerin mekano-zamansal dağılımını incelemek için CLM görüntüleme yönteminin ilk tam açıklamasıdır.
Introduction
Canlı sistemlerde ilaçların kan klirensi, doku dağılımı ve hedef doluluğu in vivo ilaç eğilimini anlamanın temel direğidir. Preklinik hayvan modellerinde, bu parametreler tipik olarak ilaç uygulama sonrası belirli zaman noktalarında sık kan ve doku örneklemesi ile değerlendirilir. Bununla birlikte, bu prosedürler genellikle istilacıdır, genellikle hayatta kalma dışı ölçümleri içerir ve istatistiksel güçlenme için büyük hayvan kohortları gerektirir. Hayvanların aşırı kullanımı için etik kaygıların yanı sıra ekstra maliyet ve zaman olabilir. Sonuç olarak, non-invaziv görüntüleme hızla biyodistributions çalışmalarında ayrılmaz bir adım haline gelmektedir. Konfokal lazer miksoskopi (CLM1,2), yüksek hassasiyetli ve yüksek çözünürlüklü canlı hayvanların gözünde terapötiklerin mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyen oküler uygulamalar için çok uygundur1,3,4.
CLM, DDS’nin kapsamlı ölçülmesi ve ilaç biyoyararlanımdan önce lipozomlar gibi oküler ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) sağlam taramasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir. Lipozomlar, çok çeşitli terapötik kargoları kapsüllemek ve ilaç salınımının doku bölgesini ve etki süresini kontrol etmek için fizikokimyasal ve biyofiziksel özelliklerini ayarlamadaki esneklikleri için çekicidir. Lipozomlar, monoklonal antikor bevacizumab12 gibi büyük moleküllerin ve siklosporin13 ve ganciclovir14 gibi küçük moleküllerin teslimi için oküler uygulamalarda kullanılmıştır. İlaç yüklü lipozomlar, lipozomal olmayan “serbest ilaç” formülasyonlarına kıyasla daha uzun biyolojik yarı ömürlere ve uzun süreli terapötik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, oküler dokudaki ilaç dağılımı tipik olarak gözün sıvı bileşenlerindeki ilaç konsantrasyonlarından (yani kan, sulu mizah ve vitreus mizahı15,16,17) tahmin edilir. Yüklü ilaç kargosunun ilk in vivo kaderi nanokarrierin özellikleri ile tanımlandığı için, floresan lipozomların CLM görüntülemesi, ilacın doku hedeflemesini ve yerinde doku ikamet sürelerini ortaya çıkarmak için bir taşıyıcı görevi görebilirsiniz. Ayrıca, CLM ile doğumun görsel kanıtları DDS’nin yeniden tasarlanmasını yönlendirebilir, ilacın terapötik faydalarını değerlendirebilir ve hatta belki de olumsuz biyolojik olayları tahmin edebilir (örneğin, DDS’nin uzun süre istenmeyen lokalizasyonuna bağlı doku toksisitesi).
Burada, çift bantlı CLM sistemine sahip canlı farelerde lipozomların oküler biyodistribasyonunun nasıl incelenerek incelenerek adım adım bir prosedür detaylandırılır. Bu özel CLM sistemi, iki renkli floresanları (488 nm ve 660 nm’de yeşil ve kırmızı heyecan lazerleri ile) gerçek zamanlı olarak, 8 kare /s frekansta algılayabilir. Algılama probunun göze fiziksel olarak yerleştirilmesiyle protokol, %2 Evans Blue (EB) boyası ile intravenöz (IV) önceden enjekte edilen farelerde subkonjonktival uygulama üzerine yeşil floresan lipozomların görüntü alımını ve analizini göstermektedir. EB boyası kırmızı floresan kanalındaki damarlı yapıların görselleştirilmesine yardımcı olur. Fosfolipid POPC’den (yani, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin) oluşan ve floresan etiketli fosfolipid Fl-DHPE (örneğin, N-(floresan-5-tiyokarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glisero-3-fosfotianolamin) % 95 POPC: % 5 Fl-DHPE (Şekil 1B) ). CLM, EB lekeli oküler doku sınırlarının tanımlaması ile yeşil floresan etiketli lipozomları 15 μm eksenel ve 3,30 μm yanal çözünürlükte yakalayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuçlardan da anlaşılır gibi CLM, gözdeki lipozomların oküler dağılımını görüntüleyen basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Daha önce clm’nin fare gözü içindeki çeşitli lipozomal formülasyonların zaman içinde lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanıldığını göstermiştik1. İstilacı olmayan uygulamalar için CLM, lipozomların aynı hayvandan göze nasıl dağıtıldığı hakkında bilgi için ön oküler yüzeyin gerçek zamanlı görüntülenmesini iz…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, NTU-Northwestern Nanomedicine Enstitüsü (NNIN) hibesi tarafından (SV’ye) ve kısmen Singapur Ulusal Araştırma Vakfı Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/201 tarafından finanse edildi. 3/2 ve Singapur Sağlık ve Biyomedikal Bilimler (HBMS) Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) bilim ajansı tarafından yönetilen H18/01/a0/018 hibesi, Teknoloji ve Araştırma (A*STAR) (AMC’ye). Duke-NUS Çeviri ve Moleküler Görüntüleme Laboratuvarı (LTMI) üyelerine, çalışmaların ve ekipmanların lojistiğini ve yürütülmesini kolaylaştıran üyelere teşekkür ederiz. Bayan Wisna Novera’ya editöryal yardımı için özel teşekkürler.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Referencias
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
