Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica
Summary
Apresentamos um protocolo para o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar não invasivamente a distribuição espátula-temporal de lipossomos no olho após injeção subconjunta.
Abstract
A injeção subconjuntiva é uma rota atraente para administrar drogas oculares devido ao fácil acesso trans-ecleral que contorna barreiras oculares anteriores, como a córnea e a conjuntiva. Embora os efeitos terapêuticos e a farmacocinética dos medicamentos após a injeção subconjuntível tenham sido descritos em alguns estudos, muito poucos avaliam a distribuição ocular de medicamentos ou sistemas de entrega de medicamentos (DDS). Este último é fundamental para a otimização do design intraocular de DDS e biodisponibilidade de medicamentos para alcançar a localização ocular desejada e duração da ação (por exemplo, aguda versus prolongada). Este estudo estabelece o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar qualitativamente a distribuição ocular de lipossomos fluorescentes em tempo real em camundongos vivos após injeção subconjuntiva. Sendo projetado para inspeção visual in vivo de tecidos no nível microscópico, esta também é a primeira descrição completa do método de imagem CLM para estudar a distribuição espátula-temporal de injetáveis no olho após injeção subconjunta.
Introduction
A liberação de sangue, a distribuição de tecidos e a ocupação-alvo de drogas em sistemas vivos são pilares para a compreensão da disposição in vivo de drogas. Em modelos animais pré-clínicos, esses parâmetros são tipicamente avaliados por amostragem frequente de sangue e tecido em determinados pontos de tempo após a administração de medicamentos. No entanto, esses procedimentos são geralmente invasivos, muitas vezes incluem medidas de não sobrevivência, e exigem grandes coortes de animais para alimentação estatística. Pode haver custo extra e tempo incorridos, juntamente com preocupações éticas para o uso excessivo de animais. Como resultado, a imagem não invasiva está rapidamente se tornando um passo integral em estudos de biodistribuções. A microendoscopia a laser confocal (CLM1,2) é adequada para aplicações oculares para imagem não invasiva da distribuição espátula-temporal da terapêutica aos olhos de animais vivos com alta sensibilidade e alta resolução1,3,4.
A CLM tem o potencial de facilitar a triagem robusta de sistemas de entrega de medicamentos oculares (DDS), como lipossomos, antes da quantificação abrangente do DDS e da biodisponibilidade de medicamentos. Os lipossomos são atraentes por sua flexibilidade em ajustar suas propriedades físico-químicas e biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular uma grande variedade de carga terapêutica e controlar o local tecidual de liberação de drogas e duração da ação. Lipossomos têm sido usados em aplicações oculares para a entrega de grandes moléculas, como o anticorpo monoclonal bevacizumab12, e pequenas moléculas como ciclosporina13 e ganciclovir14. Lipossomos carregados de drogas têm meias-vidas biológicas mais longas e efeitos terapêuticos prolongados em comparação com formulações não liposômicas de “droga livre”. No entanto, a distribuição de drogas no tecido ocular é tipicamente extrapolada das concentrações de drogas em componentes fluidos do olho (ou seja, sangue, humor aquoso e humor vítreo15,16,17). Como o destino inicial in vivo da carga de droga carregada é definido pelas propriedades do próprio nanocarrier, a imagem CLM dos lipossomos fluorescentes pode servir como um substituto para a droga revelar o direcionamento tecidual e os tempos de residência do tecido in situ. Além disso, evidências visuais de entrega com CLM podem orientar o re-projeto do DDS, avaliar os benefícios terapêuticos da droga e talvez até prever eventos biológicos adversos (por exemplo, toxicidade tecidual devido à localização indesejável do DDS por períodos prolongados de tempo).
Aqui, um procedimento passo-a-passo é detalhado sobre como estudar a biodistribução ocular de lipossomos em ratos vivos com um sistema CLM de banda dupla. Este sistema CLM específico pode detectar fluorescência de duas cores (com lasers de excitação verde e vermelho a 488 nm e 660 nm) em tempo real, com uma frequência de 8 quadros/s. Ao colocar fisicamente a sonda de detecção no olho, o protocolo demonstra a aquisição de imagens e a análise de lipossomos verde-fluorescentes sobre a administração subconjuntiva em camundongos pré-injetados por via intravenosa (IV) com 2% de corante Evans Blue (EB). O corante EB ajuda a visualizar as estruturas vascularizadas no canal de fluorescência vermelha. Mostramos resultados representativos de um estudo que avalia lipossomos neutros de 100 nm compostos do POPC fosfolipídeo (ou seja, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocholina) e dopados com fluorescemina-tagged Fl-DHPE (i.e., N-(fluoresceína-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-gliceo-3-fosfoethanolamina) a uma proporção de 95% de POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). O CLM é capaz de capturar os lipossomos marcados por fluoresceína verde a 15 μm axial e 3,30 μm de resolução lateral por delineamento das fronteiras do tecido ocular manchados pelo EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como mostrado nos resultados, o CLM fornece um método simples e viável para a imagem da distribuição ocular de lipossomos no olho. Anteriormente, demonstramos o uso de CLM para caracterizar a localização de várias formulações liposômicas dentro do olho do rato ao longo do tempo1. Para aplicações não invasivas, o CLM permite imagens em tempo real da superfície ocular anterior para obter insights sobre como os lipossomos são distribuídos no olho do mesmo animal. Isso torna o CLM adeq…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) granted (to SV) e em parte pela Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2013/2 e Cingapura’s Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund (IAF-PP) concedeM H18/01/a0/018 administrado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (para AMC). Obrigado aos membros do Laboratório Duke-NUS de Imagem Translacional e Molecular (LTMI) por facilitar a logística e execução dos estudos e treinamentos em equipamentos. Agradecimentos especiais à Sra. Wisna Novera por sua assistência editorial.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Referencias
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
