Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster
Summary
Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.
Abstract
Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.
Introduction
Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren 1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionengeboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h8 abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen 7,9.
Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätzehervorgehoben 10. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten11 auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde12, für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Te…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Rob Eifert für seine Unterstützung bei der Konstruktion und Optimierung der lasergeschnittenen Edelstahlgitter. Diese Arbeit wurde vom CSHL Cancer Center (P30-CA045508) und Mitteln für M.E. von den National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 und 5P01CA013106-49) unterstützt; CSHL und Northwell Health; die Thompson Family Foundation; Schwimmen Sie durch Amerika; und ein Stipendium der Simons Foundation an CSHL. M.S. wurde vom National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) und dem National Cancer Institute des NIH unter der Preisnummer 1F30CA253993-01 unterstützt. L.M. wird durch ein James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship unterstützt. J.M.A. erhielt ein Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wird von der Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research und der Thompson Family Foundation unterstützt. Cartoons wurden mit Biorender.com erstellt.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
Referencias
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