Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.
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Artículo de método
Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente
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Resumen
Resumen
La microscopía intravital (IVM) permite la visualización del movimiento, la división y la muerte celular a resolución de una sola célula. La IVM a través de ventanas de imágenes insertadas quirúrgicamente es particularmente poderosa porque permite la observación longitudinal del mismo tejido durante días o semanas. Las ventanas de imágenes típicas comprenden una cubierta de vidrio en un marco de metal biocompatible suturado a la piel del ratón. Estas ventanas pueden interferir con el libre movimiento de los ratones, provocar una fuerte respuesta inflamatoria y fallar debido a vidrios rotos o suturas rotas, cualquiera de las cuales puede requerir eutanasia. Para abordar estos problemas, se desarrollaron ventanas para imágenes de órganos abdominales y glándulas mamarias a largo plazo a partir de una película delgada de polidimetilsiloxano (PDMS), un polímero de silicona ópticamente transparente utilizado anteriormente para ventanas de imágenes craneales. Estas ventanas se pueden pegar directamente a los tejidos, reduciendo el tiempo necesario para la inserción. PDMS es flexible, lo que contribuye a su durabilidad en ratones a lo largo del tiempo: se han probado hasta 35 días. Las imágenes longitudinales son imágenes de la misma región del tejido durante sesiones separadas. Se incrustó una rejilla de acero inoxidable dentro de las ventanas para localizar la misma región, lo que permitió la visualización de procesos dinámicos (como la involución de la glándula mamaria) en los mismos lugares, con días de diferencia. Esta ventana de silicona también permitió el monitoreo de células cancerosas diseminadas individuales que se convierten en micrometástasis con el tiempo. Las ventanas de silicona utilizadas en este estudio son más fáciles de insertar que las ventanas de vidrio con marco de metal y causan una inflamación limitada de los tejidos fotografiados. Además, las rejillas integradas permiten un seguimiento sencillo de la misma región del tejido en sesiones repetidas de imágenes.
Introducción
La microscopía intravital (IVM), la imagen de tejidos en animales anestesiados, ofrece información sobre la dinámica de eventos fisiológicos y patológicos a resolución celular en tejidos intactos. Las aplicaciones de esta técnica varían ampliamente, pero la IVM ha sido fundamental en el campo de la biología del cáncer para ayudar a dilucidar cómo las células cancerosas invaden los tejidos y hacen metástasis, interactúan con el microambiente circundante y responden a los medicamentos 1,2,3. Además, la IVM ha sido clave para avanzar en la comprensión de los complejos mecanismos....
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las Pautas Quirúrgicas del Laboratorio de Cold Spring Harbor y habían sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio de Cold Spring Harbor.
1. Fundición de la ventana de silicona
- Prepare el polímero de silicona (PDMS) mezclando el elastómero base y el agente de curado en una proporción de 10: 1 (v / v).
- Funda una ventana depositando una pequeña cantidad de PDMS en una superficie estéril y lisa y ajusta la relación volumen-área al espesor deseado.
NOTA: El uso de 200 mg de solución de polímero pa....
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Resultados
Las imágenes intravitales a través de ventanas de imágenes se pueden usar para observar, rastrear y cuantificar una amplia gama de eventos celulares y moleculares a resolución de una sola célula durante un período de horas a semanas. Las características ideales para una ventana de imágenes incluyen: a) impacto limitado en el bienestar del ratón y la fisiología del tejido; b) durabilidad; c) simplicidad de inserción; y d) puntos de referencia claros para imágenes repetidas de la misma región. El resultado es una ventana d.......
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Discusión
Las ventanas de imágenes intravitales son herramientas importantes para visualizar directamente los procesos fisiológicos y patológicos a resolución celular a medida que se desarrollan con el tiempo. El novedoso procedimiento descrito para fundir e insertar ventanas de imágenes de silicona flexibles en ratones supera algunos de los problemas más comunes con las ventanas de imágenes utilizadas actualmente (exudado, rotura e interferencia con la movilidad normal), proporciona seguridad adicional para el ratón y aumenta la .......
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Divulgaciones
M.E. es miembro del consejo asesor de investigación de brensocatib para Insmed, Inc.; miembro del consejo asesor científico de Vividion Therapeutics, Inc.; un consultor para Protalix, Inc.; y posee acciones en Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. es cofundadora de Mestag Therapeutics, y forma parte del consejo asesor científico y posee acciones en Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology y Cygnal Therapeutics. Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a Rob Eifert por su ayuda en el diseño y optimización de las rejillas de acero inoxidable cortadas con láser. Este trabajo fue apoyado por el CSHL Cancer Center (P30-CA045508) y fondos para M.E. de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (1R01CA2374135 y 5P01CA013106-49); CSHL y Northwell Health; la Fundación de la Familia Thompson; Nadar a través de América; y una subvención de la Fundación Simons a CSHL. M.S. fue apoyado por el National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) y el National Cancer Institute of the NIH bajo el número de premio 1F30CA253993-01. L.M. cuenta con el apoyo de una b....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3M Medipore Cinta Quirúrgica de Tela Suave | 3M | 70200770819 | |
| Sutura de seda 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | Ratones N267H | |
| ACTB-ECFP Jackson | Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidasa (HRP), (3-amino-9-etilcarbazol) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Hisopos con alcohol | BD | ||
| Sistema de anestesia | Productos de imagen molecular Co. | ||
| Acqknowledge software y sensores | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) | ratones Laboratorio Jackson | 18549 | |
| ratones C57BL/6J | Laboratorio Jackson | 664 | |
| Anticuerpo monoclonal CD45 (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| Anticuerpo CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Esponjas de gasa Curity | Covidien | ||
| Burro Anti-Cabra IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Burro Anti-Conejo IgG H& L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Burro Anti-Rata IgG H& L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Encapsulante de silicona | Microscopía electrónica clara Ciencias | 24236-10 | Dos partes, relación de mezcla 10:1 |
| Vidrio de cubierta redondo, 8 mm de diámetro, espesor # 1.5 | Ciencias de la microscopía electrónica | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro Impresora 3D | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Manta térmica de infrarrojo lejano | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Bloqueador de receptores | Innovex Biosciences | NB309 | |
| procesamiento de imágenes de Fiji | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Carboxilato FluoroSpheres, 0.04µ m, amarillo-verde (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Sistema de compuerta: | BIOPAC Systems Inc. | Los componentes juntos permiten monitorear los signos vitales del ratón durante la obtención de imágenes y controlar la adquisición de imágenes en la respiración del ratón. Todos fueron adquiridos a los sistemas BIOPAC. | |
| Acqconocimiento software | ACK100W, módulo de | ||
| diferencia, serie C | DA100C | ||
| Sistema de Doble Puerta para animales | DTU200 | ||
| MP160 para Windows - Sistema de análisis | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V; 015000 | ||
| Almohadilla de presión | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Esponja de gelatina absorbible |
| Tijeras finas endurecidas | Fine Science Tools | 14090-11 | Dos pares; acero inoxidable, puntas afiladas , punta recta, filo de corte de 26 mm , 11 cm de longitud |
| Anticuerpo Humano/Ratón Mieloperoxidasa/MPO | R& D Systems | AF3667 | |
| Esterilizador de perlas | calientes Fine Science Tools | 18000-45 | Encienda aproximadamente 30 min antes de usar; Esterilizar las herramientas a >200 ° C para 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Medio de inmersión Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Jeringas de insulina con aguja ultrafina BD 6 mm x 31 G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurano (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP | ratones www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro pinzas de disección | Roboz | RS-5135 | Dentado, ligera curva, 0,8 mm de ancho de punta; 4" de longitud |
| Pinzas de microdisección | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 dientes, ligera curva, 0,8 mm de ancho de punta , 4" de longitud |
| MTS Sistemas MiniBionix II 808 | MTS | Máquina servohidráulica de prueba | |
| de materiales Sonda de elastasa de neutrófilos 680 FAST | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Suministro | de soldadura general de oxígeno Corp. | ||
| Filamento de ácido poliláctico | Hatchbox | 1,75 mm de diámetro | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Pomada oftálmica Puralube | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 pinzas para heridas | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Rejilla de acero inoxidable | Fotofab | Una rejilla tiene 0,200 pulgadas de diámetro, con un total de 52 cuadrados de rejilla individuales de 0,016 x 0,016 pulgadas. Hay 0.003 pulgadas de espacio entre cada cuadrado. | |
| Placas de cultivo de tejidos estériles tratadas en superficie | Fisher Scientific | FB012929 | Tapa utilizada como superficie de curado para ventanas de imagen |
| TriM Scope Microscopio multifotónico | LaVision BioTec | se realizaron en un microscopio vertical de 2 fotones (Trimscope, LaVision BioTec) equipado con dos láseres Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) y un oscilador paramétrico óptico. Se utilizaron los siguientes divisores de haz dicroicos de paso largo (Chroma) para dirigir la señal hacia cuatro tubos fotomultiplicadores: T560LP T665LPXXR T495lxpr | |
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cubreobjetos VWR | 48404-453 |
Referencias
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
