Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme
Summary
Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.
Abstract
İntravital mikroskopi (IVM), hücre hareketinin, bölünmesinin ve ölümünün tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilmesini sağlar. Cerrahi olarak yerleştirilmiş görüntüleme pencerelerinden IVM özellikle güçlüdür, çünkü aynı dokunun günler ila haftalar boyunca uzunlamasına gözlemlenmesine izin verir. Tipik görüntüleme pencereleri, farenin derisine dikilmiş biyouyumlu metal bir çerçevede cam bir kapak kaymasından oluşur. Bu pencereler farelerin serbest dolaşımına müdahale edebilir, güçlü bir enflamatuar yanıt ortaya çıkarabilir ve herhangi biri ötenazi gerektirebilecek kırık cam veya yırtık dikişler nedeniyle başarısız olabilir. Bu sorunları ele almak için, uzun süreli abdominal organ ve meme bezi görüntüleme pencereleri, daha önce kranial görüntüleme pencereleri için kullanılan optik olarak berrak bir silikon polimer olan ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) filminden geliştirilmiştir. Bu pencereler doğrudan dokulara yapıştırılabilir ve bu da yerleştirme için gereken süreyi azaltır. PDMS esnektir ve zaman içinde farelerde dayanıklılığına katkıda bulunur – 35 güne kadar test edilmiştir. Uzunlamasına görüntüleme, aynı doku bölgesinin ayrı seanslar sırasında görüntülenmesidir. Aynı bölgeyi lokalize etmek için pencerelerin içine paslanmaz çelik bir ızgara yerleştirildi ve dinamik süreçlerin (meme bezi evrimi gibi) aynı yerlerde, günler arayla görselleştirilmesine izin verildi. Bu silikon pencere aynı zamanda zamanla mikro-metastazlara dönüşen tek yayılmış kanser hücrelerinin izlenmesine de izin verdi. Bu çalışmada kullanılan silikon pencerelerin yerleştirilmesi metal çerçeveli cam pencerelere göre daha basittir ve görüntülenen dokuların sınırlı iltihaplanmasına neden olur. Ayrıca, gömülü ızgaralar, tekrarlanan görüntüleme oturumlarında aynı doku bölgesinin doğrudan izlenmesini sağlar.
Introduction
İntravital mikroskopi (IVM), anestezi uygulanan hayvanlarda dokuların görüntülenmesi, bozulmamış dokularda hücresel çözünürlükte fizyolojik ve patolojik olayların dinamikleri hakkında fikir verir. Bu tekniğin uygulamaları büyük ölçüde değişmektedir, ancak IVM, kanser hücrelerinin dokuları nasıl istila ettiğini ve metastaz yaptığını, çevredeki mikro çevre ile etkileşime girdiğini ve ilaçlara nasıl yanıt verdiğini aydınlatmaya yardımcı olmak için kanser biyolojisi alanında etkili olmuştur 1,2,3. Ek olarak, IVM, ex vivo profilleme yaklaşımlarına (örneğin, akış sitometrisi) tamamlayıcı içgörüler sağlayarak bağışıklık tepkilerini yöneten karmaşık mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmenin anahtarı olmuştur. Örneğin, intravital görüntüleme deneyleri, hücre göçü ve hücre-hücre teması ile ilgili olarak bağışıklık fonksiyonları hakkında ayrıntıları ortaya çıkarmış ve yaralanma veya enfeksiyona yanıt olarak uzaysal zamansal dinamikleri ölçmek için bir platform sunmuştur 4,5,6,7. Bu süreçlerin birçoğu histolojik boyama yoluyla da incelenebilir, ancak yalnızca IVM dinamik değişikliklerin izlenmesine izin verir. Aslında, histolojik bir kesit belirli bir zamanda dokunun anlık görüntüsünü sunarken, intravital görüntüleme zaman içinde aynı doku içindeki hücreler arası ve hücre altı olayları izleyebilir. Özellikle, floresan etiketlemesindeki ilerleme ve moleküler muhabirlerin gelişimi, moleküler olayların proliferasyon, ölüm, hareketlilik ve diğer hücrelerle veya hücre dışı matriks ile etkileşim gibi hücresel davranışlarla ilişkilendirilmesine izin vermiştir. Çoğu IVM tekniği, ışık saçılması nedeniyle daha derin dokuların görüntülenmesini zorlaştıran floresan mikroskopiye dayanmaktadır. Bu nedenle, ilgilenilen dokunun sıklıkla invaziv ve terminal bir prosedürle cerrahi olarak maruz bırakılması gerekir. Böylece, organ bölgesine bağlı olarak, doku birkaç ila 40 saat8 arasında değişen bir süre boyunca sürekli olarak görüntülenebilir. Alternatif olarak, kalıcı bir görüntüleme penceresinin cerrahi olarak yerleştirilmesi, aynı dokunungünler ila haftalar 7,9 arasında sırayla görüntülenmesine izin verir.
Yeni görüntüleme pencerelerinin geliştirilmesi, intravital görüntüleme yaklaşımlarını daha da geliştirmek için teknolojik bir ihtiyaç olarak vurgulanmıştır10. Prototipik intravital görüntüleme penceresi, dikişlerle cilde sabitlenmiş cam bir örtü içeren metal bir halkadır11. Serbest dolaşıma müdahale, eksüda birikimi ve cam kapak kaymasının zarar görmesi, bu tür pencerelerin kullanılmasında görülen yaygın sorunlardır. Dahası, prototipik pencere özel üretim gerektirir ve cerrahi prosedür kapsamlı bir eğitim gerektirebilir. Bu sorunları ele almak için, daha önce beyin12’de uzun süreli görüntüleme için kraniyal pencerelerde kullanılan bir silikon polimer olan polidimetilsiloksan (PDMS), abdominal organ ve meme bezi görüntülemesinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Burada, PDMS tabanlı silikon pencereler oluşturmak için, aynı doku bölgelerinin tekrarlanan görüntülenmesi için işaretler sağlamak üzere pencerenin paslanmaz çelik bir ızgaranın etrafına nasıl döküleceği de dahil olmak üzere ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, pencerenin karın organlarının veya meme bezinin üzerine yerleştirilmesi için basit, dikişsiz bir cerrahi prosedür tanımlanmıştır. Bu yeni yaklaşım, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir ve uzunlamasına intravital görüntülemenin erişilebilirliğini artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İntravital görüntüleme pencereleri, fizyolojik ve patolojik süreçleri zaman içinde ortaya çıktıklarında hücresel çözünürlükte doğrudan görselleştirmek için önemli araçlardır. Farelerde esnek, silikon görüntüleme pencerelerinin dökümü ve yerleştirilmesi için açıklanan yeni prosedür, şu anda kullanılan görüntüleme pencereleriyle (eksüda, kırılma ve normal hareketliliğe müdahale) ilgili en yaygın sorunlardan bazılarının üstesinden gelir, fare için ek güvenlik sağlar ve bu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Rob Eifert’e lazer kesimli paslanmaz çelik ızgaraların tasarlanması ve optimize edilmesindeki yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CSHL Kanser Merkezi (P30-CA045508) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (NIH) M.E. için fonlar (1R01CA2374135 ve 5P01CA013106-49) tarafından desteklenmiştir; CSHL ve Northwell Health; Thompson Aile Vakfı; Amerika’da Yüzmek; ve Simons Vakfı’ndan CSHL’ye bir hibe. Yüksek Lisans, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Tıp Bilimcisi Eğitim Programı Eğitim Ödülü (T32-GM008444) ve NIH Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından 1F30CA253993-01 ödül numarası altında desteklenmiştir. L.M., James S. McDonnell Vakfı Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. J.M.A., Kanser Araştırma Enstitüsü / Irvington Doktora Sonrası Bursu (CRI Ödülü #3435) sahibidir. D.A.T., Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Araştırmaları Özel Laboratuvarı ve Thompson Aile Vakfı tarafından desteklenmektedir. Karikatürler Biorender.com ile yaratıldı.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
Referencias
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
