Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente
Summary
Viene qui presentato un approccio per l’imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l’inserimento chirurgico provoca un’infiammazione e un disagio limitati agli animali.
Abstract
La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L’IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l’osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l’eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l’imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l’inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L’imaging longitudinale è l’imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all’interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l’involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un’infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.
Introduction
La microscopia intravitale (IVM), l’imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci 1,2,3. Inoltre, l’IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che governano le risposte immunitarie fornendo approfondimenti complementari agli approcci di profilazione ex vivo (ad esempio, citometria a flusso). Ad esempio, esperimenti di imaging intravitale hanno rivelato dettagli sulle funzioni immunitarie in relazione alla migrazione cellulare e al contatto cellula-cellula e hanno offerto una piattaforma per quantificare le dinamiche spazio-temporali in risposta a lesioni o infezioni 4,5,6,7. Molti di questi processi possono anche essere studiati attraverso la colorazione istologica, ma solo IVM consente il tracciamento dei cambiamenti dinamici. Infatti, mentre una sezione istologica offre un’istantanea del tessuto in un dato momento, l’imaging intravitale può tracciare eventi intercellulari e subcellulari all’interno dello stesso tessuto nel tempo. In particolare, i progressi nell’etichettatura della fluorescenza e lo sviluppo di reporter molecolari hanno permesso di correlare eventi molecolari con comportamenti cellulari, come la proliferazione, la morte, la motilità e l’interazione con altre cellule o la matrice extracellulare. La maggior parte delle tecniche IVM si basa sulla microscopia a fluorescenza, che a causa della diffusione della luce, rende difficile l’imaging di tessuti più profondi. Il tessuto di interesse, quindi, ha spesso bisogno di essere esposto chirurgicamente con una procedura spesso invasiva e terminale. Pertanto, a seconda del sito dell’organo, il tessuto può essere ripreso continuamente per un periodo che varia da pochi a 40 h8. In alternativa, l’inserimento chirurgico di una finestra di imaging permanente consente l’imaging dello stesso tessuto in sequenza per un periodo da giorni a settimane 7,9.
Lo sviluppo di nuove finestre di imaging è stato evidenziato come una necessità tecnologica per migliorare ulteriormente gli approcci di imaging intravitale10. La finestra di imaging intravitale prototipica è un anello metallico contenente una copertura di vetro fissata alla pelle con punti di sutura11. L’interferenza con la libera circolazione, l’accumulo di essudato e il danneggiamento del coperchio di vetro sono problemi comuni riscontrati con l’uso di tali finestre. Inoltre, la finestra prototipica richiede una produzione specializzata e la procedura chirurgica può richiedere una formazione approfondita. Per affrontare questi problemi, il polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico, che è stato precedentemente utilizzato nelle finestre craniche per l’imaging a lungo termine nel cervello12, è stato adattato per l’uso nell’imaging degli organi addominali e delle ghiandole mammarie. Qui, viene presentato un metodo dettagliato per generare finestre in silicone basate su PDMS, incluso come gettare la finestra attorno a una griglia in acciaio inossidabile per fornire punti di riferimento per l’imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Inoltre, viene descritta una procedura chirurgica semplice e priva di punti per l’inserimento della finestra sugli organi addominali o sulla ghiandola mammaria. Questo nuovo approccio supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate e aumenta l’accessibilità dell’imaging intravitale longitudinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l’inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l’accessibilità di questa …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Rob Eifert per la sua assistenza nella progettazione e ottimizzazione delle griglie in acciaio inossidabile tagliate al laser. Questo lavoro è stato sostenuto dal CSHL Cancer Center (P30-CA045508) e dai fondi per M.E. del National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; la Thompson Family Foundation; Nuota attraverso l’America; e una sovvenzione della Simons Foundation a CSHL. M.S. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio 1F30CA253993-01. L.M. è supportato da una James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. ha ricevuto una Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. è sostenuto dal Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research e dalla Thompson Family Foundation. I cartoni animati sono stati creati con Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
Referencias
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