Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen
Summary
Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.
Abstract
Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.
Introduction
Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht1. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungenauf 2,3. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzhautzellen zu Lichtreizen aufzeichnet4. Darüber hinaus erlaubt es nicht ohne weiteres die Zugabe von Medikamenten zur Netzhaut, ist anfällig für systemische Einflüsse und hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Nachteile werden in der ex vivo ERG eliminiert, die die Funktion der isolierten Netzhaut 2,3,5,6 untersucht. Das ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung großer und stabiler Reaktionen von spezifischen retinalen Zelltypen durch Zugabe pharmakologischer Inhibitoren und einfache Bewertung von Therapeutika, die dem Superfusat zugesetzt werden können. Gleichzeitig beseitigt es Einflüsse systemischer Effekte und eliminiert physiologische Geräusche (z.B. Herzschlag oder Atmung).
Bei der ex vivo ERG werden Netzhäute oder Netzhautproben isoliert und photorezeptorseitig nach oben auf der Kuppel des Probenhalters 3,5 montiert. Der Probenhalter wird zusammengebaut, mit einem Perfusionssystem verbunden, das die Netzhaut mit erhitzten, sauerstoffhaltigen Medien versorgt, und auf den Tisch eines Mikroskops gestellt, das modifiziert wurde, um computergesteuerte Lichtreize zu liefern. Um die durch Licht hervorgerufenen Reaktionen aufzuzeichnen, wird der Probenhalter an einen Verstärker, einen Digitizer und ein Aufzeichnungssystem angeschlossen (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Reaktionen von Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren, ON-Bipolarzellen und Müller-Glia, indem die Parameter der Lichtstimuli verändert und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden.
Eine vorhandene Patchklemme oder ein Multi-Elektroden-Array (MEA) kann in die Aufzeichnung von Ex-vivo-ERG umgewandelt werden, entweder in Verbindung mit einem handelsüblichen Ex-vivo-ERG-Adapter oder einem benutzerdefinierten CNC-bearbeiteten Probenhalter (Computer Numerical Control) aus Polycarbonat, um Lichtreaktionen in Netzhaut von Kleintiermodellen wie Mäusen zu messen. Diese Modifikation erhöht die Zugänglichkeit von ex vivo ERG und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Spezialgeräten. Das Design des Probenhalters vereinfacht die Montagetechnik und integriert Elektroden, wodurch die Notwendigkeit einer Manipulation von Mikroelektroden im Vergleich zu zuvor berichteten transretinalen Ex-vivo-ERG-Methoden entfällt7. Die Perfusionsrate und die Temperatur im Probenhalter sind wichtige Faktoren, die die Reaktionseigenschaften von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen beeinflussen. Durch die Anpassung dieser Bedingungen kann das ex vivo ERG zuverlässig von der isolierten Netzhaut der Maus über längere Zeiträume aufgezeichnet werden. Optimierte experimentelle Bedingungen ermöglichen ex vivo ERG-Aufnahmen in Netzhautstempeln von größeren Netzhäuten, einschließlich großer Tieraugen und menschlicher Spenderaugen8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut10 zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Method…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Eye Institute EY02665 und EY031706 und der International Retinal Research Foundation an Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), und einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, New York, NY, an das Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah, unterstützt. Dr. Frans Vinberg erhielt auch einen Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award und Dr. Silke Becker ein ARVO EyeFind-Stipendium. Wir danken Dr. Anne Hanneken vom Scripps Research Institute für die Bereitstellung des Spenderauges, das für die in Abbildung 2E gezeigten Aufnahmen verwendet wurde.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
Referencias
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
