Оптимизация установки и условий для электроретинограммы Ex Vivo для изучения функции сетчатки в маленьких и больших глазах
Summary
Модификация существующего многоэлектродного массива или патч-зажимного оборудования делает электроретинограмму ex vivo более доступной. Улучшенные методы регистрации и поддержания световых реакций ex vivo облегчают изучение функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в здоровой сетчатке, животных моделей глазных заболеваний и донорской сетчатки человека.
Abstract
Измерения световых реакций нейронов сетчатки имеют решающее значение для исследования физиологии здоровой сетчатки, определения патологических изменений при заболеваниях сетчатки и тестирования терапевтических вмешательств. Электроретинограмма ex vivo (ERG) позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток в изолированной сетчатке путем добавления специфических фармакологических агентов и оценки тканевых изменений независимо от системных воздействий. Световые реакции сетчатки могут быть измерены с помощью специализированного держателя образца ex vivo ERG и записывающей установки, модифицированной из существующего зажима патча или микроэлектродного массива. В частности, изучение ON-биполярных клеток, а также фоторецепторов было затруднено медленным, но прогрессирующим снижением световых реакций в EX VIVO ERG с течением времени. Повышенная скорость перфузии и регулировка температуры перфузата улучшают функцию сетчатки ex vivo и максимизируют амплитуду и стабильность отклика. Ex vivo ERG уникально позволяет изучать отдельные типы нейрональных клеток сетчатки. Кроме того, улучшения для максимизации амплитуд отклика и стабильности позволяют исследовать световые реакции в образцах сетчатки от крупных животных, а также в глазах доноров человека, что делает ex vivo ERG ценным дополнением к репертуару методов, используемых для исследования функции сетчатки.
Introduction
Электроретинография измеряет функцию сетчатки в ответ на свет1. Это неотъемлемая часть изучения физиологии и патофизиологии сетчатки, а также измерения успеха терапии заболеваний сетчатки. In vivo ERG широко используется для оценки функции сетчатки у интактных организмов, но имеет значительные ограничения 2,3. Среди них количественный анализ отдельных типов клеток сетчатки в IN VIVO ERG затруднен, поскольку он регистрирует сумму потенциальных изменений и, следовательно, наложение ответов от всех клеток сетчатки к световым стимулам4. Кроме того, он не позволяет добавлять лекарства к сетчатке, уязвим к системным воздействиям и имеет относительно низкое отношение сигнал/шум. Эти недостатки устраняются в ex vivo ERG, который исследует функцию изолированной сетчатки 2,3,5,6. EX vivo ERG позволяет регистрировать большие и стабильные ответы от конкретных типов клеток сетчатки путем добавления фармакологических ингибиторов и легкой оценки терапевтических агентов, которые могут быть добавлены к суперфузату. В то же время он устраняет влияние системных эффектов и устраняет физиологический шум (например, сердцебиение или дыхание).
В EX VIVO ERG сетчатку или образцы сетчатки изолируют и устанавливают фоторецепторной стороной вверх на куполе держателя образца 3,5. Держатель образца собирается, подключается к перфузионной системе, которая снабжает сетчатку нагретой, насыщенной кислородом средой, и помещается на сцену микроскопа, который был модифицирован для доставки управляемых компьютером световых стимулов. Для записи откликов, вызванных светом, держатель образца подключается к усилителю, дигитайзеру и системе записи (рисунок 1). Этот метод позволяет выделить ответы от палочковых и колбочек фоторецепторов, ON-биполярных клеток и глии Мюллера путем изменения параметров световых раздражителей и добавления фармакологических агентов.
Существующий зажим или многоэлектродный массив (MEA) может быть преобразован для записи ex vivo ERG либо в сочетании с коммерчески доступным адаптером ex vivo ERG, либо с пользовательским поликарбонатным держателем для образцов с числовым программным управлением (ЧПУ) для измерения световых реакций в сетчатке от моделей мелких животных, таких как мыши. Данная модификация повышает доступность ex vivo ERG при минимизации потребности в специализированном оборудовании. Конструкция держателя образца упрощает технику монтажа и интегрирует электроды, устраняя необходимость манипуляций с микроэлектродами по сравнению с ранее сообщенными трансретинальными методами ex vivo ERG7. Скорость перфузии и температура внутри держателя образца являются важными факторами, которые влияют на свойства ответа фоторецепторов и ON-биполярных клеток. Регулируя эти условия, EX VIVO ERG может быть надежно зарегистрирован из изолированной сетчатки мыши в течение длительных периодов времени. Оптимизированные экспериментальные условия позволяют записывать EX VIVO ERG в удары сетчатки от более крупных сетчаток, включая большие глаза животных и глаза донора человека8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первоначально разработанный в 1865 году Холмгреном для измерения световых реакций сетчатки от амфибиисетчатки 10, технические ограничения первоначально препятствовали широкому использованию ERG. Тем не менее, основополагающие исследования Рагнара Гранита и других выявили ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института глаз EY02665 и EY031706 и Международным фондом исследований сетчатки доктору Винбергу, основным грантом Национальных институтов здравоохранения (EY014800) и неограниченным грантом от исследований по предотвращению слепоты, Нью-Йорк, нью-йорк, департаменту офтальмологии и визуальных наук Университета штата Юта. Д-р Франс Винберг также является лауреатом исследования по предотвращению слепоты / Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, а д-р Силке Беккер – гранта ARVO EyeFind. Мы благодарим д-ра Энн Ханнекен из Научно-исследовательского института Скриппса за предоставление донорского глаза, используемого для записей, показанных на рисунке 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
Referencias
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
