Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi
Summary
La modifica dell’array multielettrodo esistente o delle apparecchiature patch clamp rende l’elettroretinogramma ex vivo più ampiamente accessibile. Metodi migliorati per registrare e mantenere le risposte alla luce ex vivo facilitano lo studio della funzione dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON nella retina sana, nei modelli animali di malattie degli occhi e nelle retine dei donatori umani.
Abstract
Le misurazioni delle risposte alla luce neuronale retinica sono fondamentali per studiare la fisiologia della retina sana, determinare i cambiamenti patologici nelle malattie retiniche e testare gli interventi terapeutici. L’elettroretinogramma ex vivo (ERG) consente la quantificazione dei contributi dei singoli tipi cellulari nella retina isolata mediante aggiunta di agenti farmacologici specifici e la valutazione dei cambiamenti intrinseci tissutali indipendentemente dalle influenze sistemiche. Le risposte alla luce retinica possono essere misurate utilizzando un supporto per campioni ERG ex vivo specializzato e una configurazione di registrazione, modificata da patch clamp o apparecchiature array di microelettrodi esistenti. In particolare, lo studio delle cellule ON-bipolari, ma anche dei fotorecettori, è stato ostacolato dal lento ma progressivo declino delle risposte luminose nell’ERG ex vivo nel tempo. L’aumento della velocità di perfusione e la regolazione della temperatura del perfufato migliorano la funzione retinica ex vivo e massimizzano l’ampiezza e la stabilità della risposta. L’ERG ex vivo consente unicamente lo studio dei singoli tipi di cellule neuronali retiniche. Inoltre, i miglioramenti per massimizzare le ampiezze e la stabilità della risposta consentono lo studio delle risposte alla luce in campioni di retina di animali di grandi dimensioni, nonché negli occhi di donatori umani, rendendo l’ERG ex vivo una preziosa aggiunta al repertorio di tecniche utilizzate per studiare la funzione retinica.
Introduction
L’elettroretinografia misura la funzione retinica in risposta alla luce1. È parte integrante dello studio della fisiologia e della fisiopatologia della retina e della misurazione del successo delle terapie per le malattie della retina. L’ERG in vivo è ampiamente utilizzato per valutare la funzione retinica de organismi intatti, ma presenta limitazioni significative 2,3. Tra questi, l’analisi quantitativa dei singoli tipi di cellule retiniche nell’ERG in vivo è ostacolata, poiché registra la somma dei potenziali cambiamenti, e quindi delle risposte sovrapposte, da tutte le cellule retiniche agli stimoli luminosi4. Inoltre, non consente facilmente l’aggiunta di farmaci alla retina, è vulnerabile alle influenze sistemiche e ha un rapporto segnale-rumore relativamente basso. Questi svantaggi vengono eliminati nell’ERG ex vivo che indaga la funzione della retina isolata 2,3,5,6. L’ERG ex vivo consente la registrazione di risposte ampie e stabili da specifici tipi di cellule retiniche mediante aggiunta di inibitori farmacologici e una facile valutazione degli agenti terapeutici, che possono essere aggiunti al superfusato. Allo stesso tempo, rimuove le influenze degli effetti sistemici ed elimina il rumore fisiologico (ad esempio, il battito cardiaco o la respirazione).
Nell’ERG ex vivo, le retine o i campioni retinici sono isolati e montati con il lato fotorecettore rivolto verso l’alto sulla cupola del portacampioni 3,5. Il supporto del campione è assemblato, collegato a un sistema di perfusione che fornisce alla retina mezzi riscaldati e ossigenati e posizionato sul palco di un microscopio, che è stato modificato per fornire stimoli luminosi controllati dal computer. Per registrare le risposte suscitate dalla luce, il portacampioni è collegato a un amplificatore, un digitalizzatore e un sistema di registrazione (Figura 1). Questa tecnica consente l’isolamento delle risposte dai fotorecettori dei bastoncelli e dei coni, dalle cellule bipolari ON e dalla glia di Müller modificando i parametri degli stimoli luminosi e aggiungendo agenti farmacologici.
Una patch clamp esistente o una configurazione MEA (Multi-Electrode Array) può essere convertita per registrare ex vivo ERG, in combinazione con un adattatore ERG ex vivo disponibile in commercio o un supporto per campioni lavorato a controllo numerico computerizzato (CNC) in policarbonato personalizzato, per misurare le risposte alla luce nelle retine di piccoli modelli animali, come i topi. Questa modifica aumenta l’accessibilità dell’ERG ex vivo, riducendo al minimo la necessità di attrezzature specializzate. Il design del portacampioni semplifica la tecnica di montaggio e integra gli elettrodi, eliminando la necessità di manipolazione dei microelettrodi rispetto ai metodi ERG transretinici ex vivo precedentemente riportati7. La velocità di perfusione e la temperatura all’interno del portacampioni sono fattori importanti che influenzano le proprietà di risposta dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON. Regolando queste condizioni, l’ERG ex vivo può essere registrato in modo affidabile dalla retina isolata del topo per periodi di tempo prolungati. Le condizioni sperimentali ottimizzate consentono registrazioni ERG ex vivo in punzoni retinici da retine più grandi, inclusi occhi di grandi animali e occhi di donatori umani8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Originariamente sviluppato nel 1865 da Holmgren per misurare le risposte alla luce retinica dalla retina anfibia10, i vincoli tecnici inizialmente impedirono all’ERG di essere ampiamente utilizzato. Tuttavia, studi seminali di Ragnar Granit e altri hanno identificato le origini cellulari dell’ERG e misurato le risposte dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON ex vivo11,12,13. Da allora, meto…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Eye Institute EY02665 e EY031706 e dall’International Retinal Research Foundation al Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800) e da una sovvenzione illimitata dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, NY, al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive, Università dello Utah. Il Dr. Frans Vinberg ha anche ricevuto un Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, e il Dr. Silke Becker di una sovvenzione ARVO EyeFind. Ringraziamo la dottoressa Anne Hanneken dello Scripps Research Institute per aver fornito l’occhio donatore utilizzato per le registrazioni mostrate nella Figura 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
Referencias
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
