In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn veelbelovende vectoren voor gentherapietoepassingen. Hier wordt de AAV2-vector geproduceerd door co-kweek van Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen met Sf9 cellen geïnfecteerd met baculovirus (BV)-AAV2-GFP (of therapeutisch gen) en BV-AAV2-rep-cap in serumvrije suspensiecultuur. Cellen worden gekweekt in een kolf in een orbitale shaker of Wave bioreactor. Om de AAV-deeltjes vrij te maken, worden productiecellen in bufferbevattend reinigingsmiddel gelyseerd, dat vervolgens wordt geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het cellysaat gezuiverd met behulp van AVB Sepharose-kolomchromatografie, die AAV-deeltjes bindt. Gebonden deeltjes worden gewassen met PBS om verontreinigingen te verwijderen en geëlueerd uit de hars met behulp van natriumcitraatbuffer bij pH 3,0. Het zure eluaat wordt geneutraliseerd met alkalische Tris-HCl-buffer (pH 8,0), verdund met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en verder geconcentreerd met tangentiële stroomfiltratie (TFF). Het protocol beschrijft kleinschalige preklinische vectorproductie die compatibel is met opschaling naar grootschalige klinische AAV-productie voor menselijke gentherapietoepassingen.
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn niet-omhulde menselijke parvovirussen die een enkelstrengs DNA van 4,6 kb bevatten. AAV-vectoren hebben verschillende voordelen ten opzichte van andere virale vectoren voor gentherapietoepassingen1,2,3,4. AAV’s zijn van nature replicatie-incompetent, waardoor een helpervirus en gastheermachinerie nodig zijn voor replicatie. AAV’s veroorzaken geen ziekte en hebben een lage immunogeniciteit in de geïnfecteerde gastheer3,5. AAV kan zowel rustige als actief delende cellen infecteren en kan als episoom blijven bestaan zonder te integreren in het genoom van de gastheercellen (AAV integreert zelden in het gastheergenoom)1,3. Deze kenmerken hebben AAV tot een wenselijk hulpmiddel gemaakt voor gentherapietoepassingen.
Om een AAV-genoverdrachtsvector te genereren, wordt de transgencassette, inclusief het therapeutische gen, gekloond tussen twee interne terminale herhalingen (ITR’s), die meestal zijn afgeleid van het AAV-serotype 2. De maximale grootte van 5′ ITR tot 3′ ITR, inclusief de transgensequentie, is 4,6 kb6. Verschillende capsiden kunnen een ander cel- of weefseltropisme hebben. Daarom moeten capsiden worden gekozen op basis van het weefsel- of celtype dat bedoeld is om te worden gericht met de AAV-vector7.
Recombinante AAV-vectoren worden vaak geproduceerd in zoogdiercellijnen zoals menselijke embryonale niercellen, HEK293 door voorbijgaande transfectie van de AAV-genoverdrachtsvector, AAV rep-cap en helpervirusplasmiden2,3. Er zijn echter verschillende beperkingen voor grootschalige AAV-productie door voorbijgaande transfectie van adherente HEK293-cellen. Ten eerste is een groot aantal celstapels of rolflessen nodig. Ten tweede zijn hoogwaardige plasmide-DNA en transfectiereagentia nodig, wat de productiekosten verhoogt. Ten slotte is het serum bij het gebruik van adherente HEK293-cellen vaak nodig voor een optimale productie, wat de downstream-verwerking1,2,3bemoeilijkt. Een alternatieve methode van AAV-productie omvat het gebruik van de insectencellijn, Spodoptera frugiperda (Sf9) -cellen en een insectenvirus genaamd recombinant Autographa californica multicapsid nucleair polyhedrosevirus (AcMNPV of baculovirus)8,9,10. Sf9-cellen worden gekweekt in serumvrije suspensiecultuur die gemakkelijk op te schalen is en compatibel is met de huidige productie van goede productiepraktijken (cGMP) op grote schaal, waarvoor geen plasmide- of transfectiereagentia nodig zijn. Bovendien zijn de kosten van de AAV-productie met behulp van het Sf9-baculovirussysteem lager dan de kosten van het gebruik van voorbijgaande transfectie van plasmiden in HEK293-cellen11.
Het oorspronkelijke rAAV-productiesysteem met baculovirus-Sf9-cellen gebruikte drie baculovirussen: een baculovirus met genoverdrachtcassette, het tweede baculovirus met rep-gen en het derde baculovirus met serotype-specifiek capsid-gen12,13. Het baculovirus bevattende rep-construct was echter genetisch instabiel bij meerdere passagerondes, wat amplificatie van het baculovirus voor de grootschalige AAV-productie voorkwam. Om dit probleem op te lossen, werd een nieuw rAAV-vectorsysteem ontwikkeld, dat twee baculovirussen (TwoBac) bevatte: een baculovirus met de AAV-genoverdrachtcassette en een ander baculovirus dat de AAV-rep-cap-genen samen bevat die genetisch stabieler zijn dan het oorspronkelijke systeem en handiger om rAAV te produceren vanwege het gebruik van TwoBac in plaats van drie14, 15. Het OneBac-systeem maakt gebruik van de AAV-genoverdrachtcassette en de rep-cap-genen in een enkel baculovirus, wat handiger is om de rAAV te produceren vanwege het gebruik van één baculovirus in plaats van TwoBac of ThreeBac2,16,17. In onze studie werd het TwoBac-systeem gebruikt voor optimalisatie.
Het baculovirussysteem voor AAV-productie heeft ook beperkingen: baculovirusdeeltjes zijn onstabiel voor langdurige opslag in serumvrij medium11, en als de baculovirustiter laag is, is een groot volume baculovirussupernatant nodig, dat giftig kan worden voor de groei van Sf9-cellen tijdens AAV-productie (persoonlijke observatie). Het gebruik van titerloze infected-cell preservation and scale-up (TIPS) cellen, of baculovirus-geïnfecteerde insectencellen (BIIC), biedt een goede optie voor AAV-productie waarbij baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen worden bereid, gecryopreserveerd en vervolgens gebruikt voor infectie van verse Sf9-cellen. Een ander voordeel is de verhoogde stabiliteit van baculovirus (BV) in Sf9-cellen na cryopreservatie10,11.
Twee soorten TIPS-cellen worden gegenereerd om AAV-productie mogelijk te maken: de eerste door infectie van Sf9-cellen met het BV-AAV2-GFP of therapeutische gen, en de tweede door infectie van Sf9-cel met BV-AAV2-rep-cap. TIPS-cellen worden gecryopreserveerd in kleine en gebruiksklare aliquots. AAV-vectoren worden geproduceerd in serumvrije suspensiecultuur in een kolf die in een orbitale shaker of Wave-bioreactor wordt geplaatst door TIPS-cellen die baculovirussen en verse Sf9-cellen produceren, samen te kweken. Sf9-cellen worden geïnfecteerd door baculovirussen die de AAV2-GFP-vector en de rep-cap-sequenties dragen om AAV te genereren. Vier tot vijf dagen later, wanneer de AAV-opbrengsten het hoogst zijn, worden de productiecellen gelyseerd met wasmiddel om de AAV-deeltjes vrij te geven. Het cellysaat wordt vervolgens geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het lysaat gezuiverd door AVB Sepharose-kolomchromatografie. Ten slotte worden AAV-vectoren geconcentreerd met behulp van TFF. Het protocol beschrijft de productie van AAV op kleine schaal, nuttig voor onderzoek en preklinische studies. De methoden zijn echter schaalbaar en compatibel met de productie van klinische AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen.
De parameters die in dit protocol worden gebruikt voor de procesontwikkeling van productie, zuivering en concentratie van AAV-vectoren kunnen worden toegepast op zowel kleine als grootschalige productie van AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen. Het gehele upstream en downstream proces kan worden uitgevoerd in een gesloten systeem dat compatibel is met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP). De grote voordelen van het Sf9-baculovirussysteem zijn schaalbaarheid voor grootschalige GMP-grade AAV-productie tegen …
The authors have nothing to disclose.
We willen Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) bedanken voor het genereus verstrekken van de AAV-plasmiden en Danielle Steele en Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) voor hun technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door het Start-Up fonds van Cincinnati Children’s Research Foundation aan M.N.
1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |