바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발
Summary
본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.
Abstract
Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 유망한 벡터입니다. 여기서, AAV2 벡터는 스페큘로바이러스(BV)-AAV2-GFP(또는 치료 유전자) 및 BV-AAV2-rep-rep-cap-serum-free 서스펜션 배양에 감염된 Sf9 세포를 가진 Spodoptera 검소페라(Sf9) 세포의 공동 배양에 의해 생성된다. 세포는 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에서 플라스크에서 배양됩니다. AAV 입자를 방출하기 위해, 생산자 세포는 세제를 포함하는 완충액으로 용액이 되며, 이는 이후 저속 원심분리 및 여과에 의해 명확화된다. AAV 입자는 AAV 입자를 결합하는 AVB 세포로즈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포 용해로부터 정제됩니다. 바운드 입자는 PBS로 세척되어 오염 물질을 제거하고 pH 3.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 사용하여 수지에서 용출된다. 산성 용출은 알칼리성 Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)로 중화되고, 인산염 완충식식(PBS)으로 희석되고, 접선 유동 여과(TFF)로 더 농축된다. 이 프로토콜은 인간 유전자 치료 응용 을 위한 대규모 임상 급 AAV 제조에 규모업과 호환되는 소규모 전임상 벡터 생산을 설명합니다.
Introduction
Adeno 관련 바이러스(AAV)는 4.6 kb의 단일 좌초 DNA를 포함하는 비 봉투인간 파르보바이러스이다. AAV 벡터는 유전자 치료 응용 프로그램1,2,3,4에대한 다른 바이러스 벡터에 비해 몇 가지 장점이 있다. AAV는 자연적으로 복제할 수 없기 때문에 복제를 위해 도우미 바이러스와 호스트 기계가 필요합니다. AAV는 어떤 질병도 일으키지 않으며 감염된 숙주3,5에서면역원성이 낮다. AAV는 세포를 정지하고 능동적으로 분할하는 세포를 모두 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합하지 않고 피형으로 지속될 수 있습니다(AAV는 거의 숙주 게놈에 통합되지 않습니다)1,3. 이러한 특징은 AAV유전자 치료 응용 프로그램에 대한 바람직한 도구를 만들었습니다.
AAV 유전자 전달 벡터를 생성하기 위해, 치료 유전자를 포함하는 트랜스진 카세트는, 전형적으로 AAV 혈청형 2로부터 유래되는 2개의 내부 말단 반복(ItRs) 사이에서 복제된다. 5’ITR에서 3′ ITR까지의 최대 크기는 트랜스진 서열을 포함하여 4.6 kb6이다. 상이한 capsids는 다른 세포 또는 조직 트로피즘이 있을 수 있습니다. 따라서, 캡시드는 AAV 벡터7로표적화되기 위한 조직 또는 세포 유형에 기초하여 선택되어야 한다.
재조합 AAV 벡터는 일반적으로 인간 배아 신장 세포, HEK293 과도 성 AAV 유전자 전달 벡터, AAV rep-cap 및 도우미 바이러스 플라스미드2,3과같은 포유류 세포주에서 일반적으로 생산된다. 그러나, 부착 HEK293 세포의 일시적인 과도 한 과도 한 연동에 의해 대규모 AAV 생산을 위한 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 많은 수의 셀 스택이나 롤러 병이 필요합니다. 둘째, 고품질 플라스미드 DNA 및 트랜스프션 시약이 필요하며, 이는 제조 비용을 증가시킵니다. 마지막으로, 부착된 HEK293 세포를 사용할 때, 혈청은 최적의 생산을 위해 자주 필요하며, 다운스트림 처리1,2,3을복잡하게 만든다. AAV 제조의 대안 방법은 곤충 세포주, 스포드옵테라 검거(Sf9) 세포, 및 재조합 사인 칼리포니카 다중캡슐핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV 또는 바쿨로바이러스)8,9,10을사용하는 것을 포함한다. Sf9 세포는 확장이 용이하고 플라스미드 또는 트랜스페션 시약을 필요로하지 않는 대규모로 현재의 좋은 제조 관행 (cGMP) 생산과 호환되는 혈청없는 서스펜션 배양에서 재배됩니다. 더욱이, Sf9-바쿨로바이러스 시스템을 이용한 AAV 생산비용은 HEK293세포(11)로플라스미드의 과도한 과도순환을 사용하는 비용보다 낮다.
바쿨로바이러스-Sf9 세포를 이용한 본래의 rAAV 생산 시스템은 유전자 전달 카세트를 함유한 바쿨로바이러스 1개, 렙레유전자를 함유한 제2바쿨로바이러스, 혈청형 특이적 캡시드 유전자12,13을함유한 제3바쿨로바이러스를 사용했다. 그러나, rep 구조를 포함하는 바큘로바이러스는 대규모 AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스의 증폭을 방지하는 여러 통로에 유전적으로 불안정했습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 새로운 rAAV 벡터 시스템이 개발되었다, 이는 두 개의 바쿨로 바이러스를 포함 (TwoBac): AAV 유전자 전송 카세트를 포함하는 하나의 바큘로 바이러스와 원래 시스템보다 유전적으로 더 안정적이고 3 개의14대신 2박을 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리AAV를 생산하는 것이 더 편리합니다. 15. OneBac 시스템은 2박 또는 ThreeBac2,16,17을사용하는 대신 하나의 바큘로바이러스를 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리한 단일 바쿨로바이러스에서 AAV 유전자 전달 카세트 및 렙캡유전자를사용합니다. 우리의 연구에서, TwoBac 시스템은 최적화에 사용되었다.
AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스 시스템은 또한 한계가 있습니다: baculovirus 입자는 혈청 없는 매체11에있는 장기 저장을 위한 불안정하고, 바쿨로바이러스 티터가 낮으면, AAV 생산 도중 Sf9 세포의 성장에 유독할 수 있는 바쿨로바이러스 상피제의 다량이 필요합니다 (개인 관측). 티터가 없는 감염세포 보존 및 스케일업(TIPS) 세포 또는 바큘로바이러스감염 곤충 세포(BIIC)의 사용은 바쿨로바이러스감염Sf9 세포가 제조되고, 냉동 보존되고, 이후에 신선한 Sf9 세포의 감염에 사용되는 AAV 생산을 위한 좋은 선택권을 제공한다. 또 다른 장점은 극저온 보존 후 Sf9 세포에서 바쿨로바이러스(BV)의 안정성이 증가하여10,11이다.
팁 세포의 두 가지 유형은 AAV 생산을 가능하게 하기 위하여 생성됩니다: BV-AAV2-GFP 또는 치료 유전자를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 첫번째, BV-AAV2-rep-cap를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 두 번째. TIPS 세포는 작고 즉시 사용할 수 있는 알리쿼트에서 냉동 보존됩니다. AAV 벡터는 바쿨로바이러스및 신선한 Sf9 세포를 생성하는 TIPS 세포를 공동 배양하여 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에 배치된 플라스크에서 혈청 없는 서스펜션 배양으로 생산됩니다. Sf9 세포는 AAV2-GFP 벡터및 렙캡 서열을 운반하는 바큘로바이러스에 의해 감염되어 AAV를 생성한다. 4~5일 후, AAV 수율이 가장 높은 경우, 생산자 세포는 세제로 리세팅되어 AAV 입자를 방출합니다. 세포 용액은 이후 저속 원심 분리 및 여과에 의해 명확화됩니다. AAV 입자는 AVB 세파로즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 용해로부터 정제된다. 마지막으로 AAV 벡터는 TFF를 사용하여 농축됩니다. 이 프로토콜은 연구 및 전임상 연구에 유용한 소규모AAV 생산을 설명합니다. 그러나, 이 방법은 유전자 치료 응용을 위한 임상급 AAV 벡터제조와 확장가능하고 호환된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV 벡터의 생산, 정제 및 농도의 공정 개발을 위해 이 프로토콜에 사용되는 파라미터는 유전자 치료 응용을 위한 AAV 벡터의 소규모 및 대규모 제조 모두에 적용될 수 있다. 전체 업스트림 및 다운스트림 프로세스는 현재 의 양호한 제조 관행(cGMP)과 호환되는 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있습니다. Sf9-baculovirus 시스템의 주요 장점은 저렴한 비용으로 대규모 GMP 급 AAV 생산을 위한 확장성입니다. 이 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 로버트 M. 코틴 박사 (국립 심장, 혈액 및 폐 연구소, NIH) 우리에게 AAV 플라스미드와 다니엘 스틸과 레베카 에른스트 (신시내티 어린이 병원)를 아낌없이 제공하는 데 감사드립니다. 이 작품은 신시내티 아동 연구 재단에서 M.N에 이르는 스타트업 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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