バキュロウイルス昆虫細胞培養システムを用いたアデノ関連ウイルス(AAV)2ベクターの製造と精製のためのプロセス開発
Summary
このプロトコルでは、AAV2ベクターは、バキュロ ウイルス (BV)-AAV2-緑色蛍光タンパク質(GFP)または治療遺伝子およびBV-AAV2-Rep-cap感染したSf9細胞を懸濁培養中にSf9細胞と共培養することによって産生される。AAV粒子は、洗浄剤を使用して細胞から放出され、精製され、親和性カラムクロマトグラフィーによって精製され、接線流ろ過によって濃縮される。
Abstract
アデノ関連ウイルス(AAV)は、遺伝子治療用途に有望なベクターです。ここで、AAV2ベクターは、BV-AAV2-GFP(または治療遺伝子)とBV-AAV2-rep-capを無血清懸濁液培養においてBf9細胞に感染させたSf9細胞を有する スポドプテラ・フルギペルダ (Sf9)細胞の共培養によって産生される。細胞は、軌道シェーカーまたはウェーブバイオリアクター内のフラスコで培養される。AAV粒子を放出するために、生産者細胞は、後に低速遠心分離および濾過によって明らかにされる洗剤を含む緩衝液中に取り込まれる。AAV粒子は、AAV粒子を結合するAVBセファローズカラムクロマトグラフィーを使用して細胞溶解物から精製される。結合粒子をPBSで洗浄し、pH3.0でクエン酸ナトリウムバッファーを使用して汚染物質を除去し、樹脂から溶出する。酸性溶出物はアルカリ性Tris-HCl緩衝液(pH-8.0)で中和し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、さらに接線流ろ過(TFF)で濃縮する。このプロトコルは、ヒト遺伝子治療用途向けの大規模臨床グレードのAAV製造に対するスケールアップと互換性のある小規模な前臨床ベクター産生を記述する。
Introduction
アデノ関連ウイルス(AAV)は、4.6kbの一本鎖DNAを含む非エンベロープヒトパルボウイルスである。AAVベクターは、遺伝子治療アプリケーション1、2、3、4に対する他のウイルスベクターに対していくつかの利点があります。AAV は自然にレプリケーションを行う必要がなっており、それにより、レプリケーションにはヘルパー ウイルスとホストマシンが必要になります。AAVは、感染した宿主3,5において疾患を引き起こせず、免疫原性が低い。AAVは静止細胞と積極的に分裂する細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに統合することなくエピソームとして持続する(AAVはめったに宿主ゲノムに統合しない)1,3。これらの特徴はAAVを遺伝子治療の適用のための望ましい用具にした。
AAV遺伝子導入ベクターを生成するために、治療用遺伝子を含むトランスジーンカセットは、2つの内部末端反復(ITR)の間でクローニングされ、これは典型的にはAAV血清型2に由来する。5′ ITR から 3′ ITR までの最大サイズは、トランスジーン配列を含めて 4.6 kb6 です。異なるキャプシドは、異なる細胞または組織のトロピズムを有することができる。したがって、カプシドは、AAVベクター7で標的とされることを意図した組織または細胞タイプに基づいて選択されるべきである。
組換えAAVベクターは、ヒト胚性腎臓細胞などの哺乳動物細胞株において一般的に産生されるが、HEK293はAAV遺伝子導入ベクターの一過性トランスフェクションによって、AAV rep-cap、およびヘルパーウイルスプラスミド2,3である。しかしながら、付着性HEK293細胞の一過性トランスフェクションによる大規模なAAV産生にはいくつかの制限がある。まず、多数のセルスタックまたはローラーボトルが必要です。第2に、高品質のプラスミドDNAとトランスフェクション試薬が必要であり、製造コストが増加します。最後に、付着性HEK293細胞を使用する場合、血清は最適な生産のために頻繁に必要とされ、下流処理1、2、3を複雑にする。AAV製造の代替方法は、昆虫細胞株、スポドプテラ・フルギペルダ(Sf9)細胞、および組換えオートグラフ・カリフォルニカ多重重体核多重体症ウイルス(AcMNPVまたはバクロウイルス)8、9、10と呼ばれる昆虫ウイルスを使用することを含む。Sf9細胞は、スケールアップが容易で、現在の良好な製造実践(cGMP)生産と大規模な製造に対応する無血清懸濁液培養で増殖し、プラスミドやトランスフェクション試薬を必要としません。また、Sf9-バキュロウイルス系を用いたAAV産生のコストは、HEK293細胞11へのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いたコストよりも低い。
バキュロウイルス-Sf9細胞を用いた元のrAAV産生系は、3つのバキュロウイルスを用いた:遺伝子導入カセットを含む1つのバキュロウイルス、Rep遺伝子を含む第2のバキュロウイルス、および血清型特異的キャプシド遺伝子12、13を含む第3のバキュロウイルス。しかし、rep構築物を含むバキュロウイルスは、複数の通過時に遺伝的に不安定であったため、大規模なAAV産生のためのバキュロウイルスの増幅を妨げた。この問題を解決するために、2つのバキュロウイルス(TwoBac)を含む新しいrAAVベクターシステムが開発されました:AAV遺伝子導入カセットを含む1つのバキュロウイルスと、元のシステムよりも遺伝的に安定しており、3つの14の代わりにTwoBacを使用しているためにrAAVを生成するのに便利なAAVレップ遺伝子を含む別のバキュロウイルス、 15.OneBacシステムは、単一のバキュロウイルスにおいてAAV遺伝子導入カセットおよびRep-cap遺伝子を用い、TwoBacまたはThreeBac2、16、17を使用する代わりに1つのバキュロウイルスを使用するため、rAAVを産生する方が便利である。我々の研究では、TwoBacシステムは最適化のために使用された。
AAV産生のためのバキュロウイルスシステムにも制限があります:バキュロウイルス粒子は、無血清培地11中で長期保存のために不安定であり、バキュロウイルス価が低い場合、大量のバキュロウイルス上清が必要であり、AAV産生中にSf9細胞の増殖に毒性を持つ可能性があります(個人的な観察)。価動菌を使用して、増殖を防除する感染細胞保存とスケールアップ (TIPS) 細胞、またはバキュロウイルス感染昆虫細胞 (BIIC) は、バキュロウイルスに感染した Sf9 細胞を調製し、凍結保存し、その後、新鮮な Sf9 細胞の感染に使用する AAV 産生に適した選択肢を提供します。もう一つの利点は、凍結保存10、11の後のSf9細胞におけるバキュロウイルス(BV)の安定性の増加である。
AAV産生を可能にする2種類のTIPS細胞が生成される:BV-AAV2-GFPまたは治療遺伝子によるSf9細胞の感染による最初の細胞と、BV-AAV2-rep-capによるSf9細胞の感染による第2の細胞。TIPS細胞は、小さくてすぐに使えるアリコートで凍結保存されています。AAVベクターは、バキュロウイルスおよび新鮮なSf9細胞を産生するTIPS細胞を共培養することによって、軌道シェーカーまたはウェーブバイオリアクターに置かれたフラスコ中の無血清懸濁液培養で産生される。Sf9細胞はAAV2-GFPベクターとRep-cap配列を運ぶバキュロウイルスに感染してAAVを生成する。4~5日後、AAV収量が最も高い場合、生産者細胞は洗浄剤で洗浄され、AAV粒子を放出する。細胞のライセートは、その後、低速遠心分離および濾過によって明らかにされる。AAV粒子は、AVBセファローズカラムクロマトグラフィーによって溶解物から精製される。最後に、AAV ベクターは TFF を使用して濃縮されます。プロトコルは、研究や前臨床試験に有用な小規模でのAAVの生産を記述します。しかし、この方法は、遺伝子治療用途向けの臨床グレードのAAVベクターの製造と拡張性と互換性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
AAVベクターの製造、精製、および濃度のプロセス開発のためにこのプロトコルで使用されるパラメータは、遺伝子治療用途のためのAAVベクターの小規模および大規模な製造の両方に適用することができます。アップストリームおよびダウンストリームプロセス全体は、現在のグッドマニュファクチャリングプラクティス(cGMP)と互換性のある閉じたシステムで実行できます。Sf9-baculoウイルスシ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ロバート・M・コティン博士(NIH国立心臓・血液・肺研究所)がAAVプラスミドとダニエル・スティールとレベッカ・エルンスト(シンシナティ小児病院)に技術支援を提供してくれたことに感謝します。この作品は、シンシナティ児童研究財団からM.N.へのスタートアップ基金によって支援されています。
Materials
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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