Metodo Digital Droplet PCR per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV nella retina murina
Summary
Questo protocollo presenta come quantificare l’efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all’iniezione intravitreale, all’imaging retinico e all’isolamento del DNA genomico retinico.
Abstract
Molti laboratori di biologia cellulare retinica ora utilizzano abitualmente virus adeno-associati (AAV) per l’editing genetico e le applicazioni regolatorie. L’efficienza della trasduzione AAV è solitamente critica, il che influisce sui risultati sperimentali complessivi. Uno dei principali determinanti per l’efficienza di trasduzione è il sierotipo o la variante del vettore AAV. Attualmente, sono disponibili vari sierotipi e varianti AAV artificiali con diverse affinità con i recettori di superficie delle cellule ospiti. Per la terapia genica retinica, ciò si traduce in vari gradi di efficienza di trasduzione per diversi tipi di cellule retiniche. Inoltre, la via di iniezione e la qualità della produzione di AAV possono anche influenzare le efficienze di trasduzione AAV retinica. Pertanto, è essenziale confrontare l’efficienza di diverse varianti, lotti e metodologie. Il metodo digital droplet PCR (dd-PCR) quantifica gli acidi nucleici con elevata precisione e consente di eseguire la quantificazione assoluta di un dato target senza alcuno standard o riferimento. Utilizzando la dd-PCR, è anche possibile valutare le efficienze di trasduzione degli AAV mediante quantificazione assoluta dei numeri di copia del genoma AAV all’interno di una retina iniettata. Qui, forniamo un metodo semplice per quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nelle cellule retiniche utilizzando la dd-PCR. Con piccole modifiche, questa metodologia può anche essere la base per la quantificazione del numero di copie del DNA mitocondriale e per valutare l’efficienza dell’editing di base, fondamentale per diverse malattie della retina e applicazioni di terapia genica.
Introduction
I virus associati all’adeno (AAV) sono ora comunemente usati per una varietà di studi di terapia genica retinica. Gli AAV forniscono un modo sicuro ed efficiente di consegna genica con meno immunogenicità e meno integrazioni del genoma. L’ingresso di AAV nella cellula bersaglio avviene attraverso l’endocitosi, che richiede il legame di recettori e co-recettori sulla superficie cellulare1,2. Pertanto, l’efficienza di trasduzione degli AAV per diversi tipi di cellule dipende principalmente dal capside e dalle sue interazioni con i recettori delle cellule ospiti. Gli AAV hanno sierotipi e ogni sierotipo può avere tropismi cellulari / tissutali distinti ed efficienze di trasduzione. Esistono anche sierotipi e varianti AAV artificiali generati dalla modifica chimica del capside virale, dalla produzione di capsidi ibridi, dall’inserimento di peptidi, dal rimescolamento del capside, dall’evoluzione diretta e dalla mutagenesi razionale3. Anche piccoli cambiamenti nella sequenza aminoacidica o nella struttura del capside possono avere un’influenza sulle interazioni con i fattori delle cellule ospiti e provocare diversi tropismi4. Oltre alle varianti di capside, altri fattori come la via di iniezione e la variazione da lotto a lotto della produzione di AAV possono influenzare l’efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per il confronto dei tassi di trasduzione per diverse varianti.
La maggior parte dei metodi per determinare l’efficienza di trasduzione AAV si basa sull’espressione genica del reporter. Questi includono imaging fluorescente, immunoistochimica, western blot o analisi istochimica del prodotto del gene reporter5,6,7. Tuttavia, a causa del vincolo dimensionale degli AAV, non è sempre possibile includere geni reporter per monitorare l’efficienza di trasduzione. L’uso di promotori forti come l’ibrido CMV enhancer/chicken beta-actin o Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) come sequenza di stabilizzatori di mRNA complica ulteriormente il problema delle dimensioni8. Pertanto, sarà anche utile definire il tasso di trasduzione degli AAV iniettati con una metodologia più diretta.
La PCR a goccia digitale (dd-PCR) è una potente tecnica per quantificare il DNA bersaglio da piccole quantità di campioni. La tecnologia dd-PCR dipende dall’incapsulamento del DNA bersaglio e dalla miscela di reazione PCR da parte di goccioline d’olio. Ogni reazione dd-PCR contiene migliaia di goccioline. Ogni goccia viene elaborata e analizzata come reazione PCR indipendente9. L’analisi delle goccioline consente di calcolare il numero assoluto di copie delle molecole di DNA bersaglio in qualsiasi campione semplicemente utilizzando l’algoritmo di Poisson. Poiché l’efficienza di trasduzione degli AAV è correlata al numero di copie dei genomi AAV nella retina neuronale, abbiamo usato il metodo dd-PCR per quantificare i genomi AAV.
Qui, descriviamo una metodologia dd-PCR per calcolare l’efficienza di trasduzione di vettori AAV dal DNA genomico retinico6,10. In primo luogo, gli AAV che esprimono il reporter tdTomato sono stati generati utilizzando il protocollo su piccola scala e titered dal metodo dd-PCR11. In secondo luogo, gli AAV sono stati iniettati per via intravitreale nella retina neuronale. Per dimostrare l’efficienza di trasduzione, abbiamo prima quantificato l’espressione di tdTomato utilizzando la microscopia fluorescente e il software ImageJ. Questo è stato seguito dall’isolamento del DNA genomico per la quantificazione dei genomi AAV nelle retine iniettate utilizzando la dd-PCR. Il confronto dei livelli di espressione di tdTomato con i genomi AAV trasdotti quantificati dalla dd-PCR ha mostrato che il metodo dd-PCR ha quantificato accuratamente l’efficienza di trasduzione dei vettori AAV. I nostri protocolli hanno dimostrato una descrizione dettagliata di una metodologia basata su dd-PCR per quantificare le efficienze di trasduzione AAV. In questo protocollo, mostriamo anche il numero assoluto di genomi AAV che vengono trasdotti dopo iniezioni intravitreali semplicemente utilizzando il fattore di diluizione dopo l’isolamento del DNA genomico e i risultati della dd-PCR. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo potente, che sarebbe un’alternativa all’espressione del reporter per quantificare le efficienze di trasduzione dei vettori AAV nella retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo generato due vettori AAV che hanno diverse proteine del capside e poi li abbiamo titolati di conseguenza. Uno dei passaggi più cruciali di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di AAV che produrranno un’espressione reporter rilevabile dopo la trasduzione12,13.
Il titering degli AAV è anche un fattore importante per regolare i dosaggi di AAV per le iniezioni intravitreali. Una v…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Oezkan Keles, Josephine Jüttner e il Prof. Botond Roska, Istituto di Oftalmologia Molecolare e Clinica di Basilea, Complex Viruses Platform per il loro aiuto e supporto per la produzione di AAV. Vorremmo anche ringraziare il Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, l’Università della Pennsylvania per il ceppo AAV8 / BP2. Il lavoro sugli animali viene eseguito presso la struttura per animali della Gebze Technical University. Per questo, ringraziamo Leyla Dikmetas e il Prof. Uygar Halis Tazebay per l’assistenza tecnica e il supporto alla zootecnia. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Fatma Ozdemir per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è supportato da TUBITAK, grant numbers 118C226 e 121N275, e Sabanci University Integration grant.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
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