Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina
Summary
Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.
Abstract
Muchos laboratorios de biología celular de la retina ahora usan rutinariamente virus adenoasociados (AAV) para la edición de genes y aplicaciones regulatorias. La eficiencia de la transducción AAV suele ser crítica, lo que afecta los resultados experimentales generales. Uno de los principales determinantes para la eficiencia de transducción es el serotipo o variante del vector AAV. Actualmente, varios serotipos y variantes artificiales de AAV están disponibles con diferentes afinidades con los receptores de la superficie de la célula huésped. Para la terapia génica retiniana, esto resulta en diversos grados de eficiencia de transducción para diferentes tipos de células retinianas. Además, la ruta de inyección y la calidad de la producción de AAV también pueden afectar la eficiencia de la transducción de AAV retiniana. Por lo tanto, es esencial comparar la eficiencia de diferentes variantes, lotes y metodologías. El método de PCR digital de gotas (dd-PCR) cuantifica los ácidos nucleicos con alta precisión y permite realizar la cuantificación absoluta de un objetivo determinado sin ningún estándar o referencia. Utilizando dd-PCR, también es factible evaluar las eficiencias de transducción de los AV mediante la cuantificación absoluta de los números de copias del genoma AAV dentro de una retina inyectada. Aquí, proporcionamos un método sencillo para cuantificar la tasa de transducción de AAV en células de la retina utilizando dd-PCR. Con modificaciones menores, esta metodología también puede ser la base para la cuantificación del número de copias del ADN mitocondrial, así como para evaluar la eficiencia de la edición de bases, crítica para varias enfermedades de la retina y aplicaciones de terapia génica.
Introduction
Los virus adeno asociados (AVA) ahora se usan comúnmente para una variedad de estudios de terapia génica retiniana. Los AAV proporcionan una forma segura y eficiente de administración de genes con menos inmunogenicidad y menos integraciones del genoma. La entrada de AAV en la célula diana se produce a través de la endocitosis, que requiere la unión de receptores y co-receptores en la superficie celular1,2. Por lo tanto, la eficiencia de transducción de los AV para diferentes tipos de células depende principalmente de la cápside y sus interacciones con los receptores de la célula huésped. Los AAV tienen serotipos y cada serotipo puede tener tropismos celulares / tisulares distintos y eficiencias de transducción. También existen serotipos y variantes artificiales de AAV generados por modificación química de la cápside del virus, producción de cápsides híbridas, inserción de péptidos, barajado de la cápside, evolución dirigida y mutagénesis racional3. Incluso cambios menores en la secuencia de aminoácidos o la estructura de la cápside pueden influir en las interacciones con los factores de la célula huésped y dar lugar a diferentes tropismos4. Además de las variantes de la cápside, otros factores como la ruta de inyección y la variación de lote a lote de la producción de AAV pueden afectar la eficiencia de transducción de los AV en la retina neuronal. Por lo tanto, se necesitan métodos fiables para la comparación de las tasas de transducción para diferentes variantes.
La mayoría de los métodos para determinar la eficiencia de la transducción AAV se basan en la expresión génica del informador. Estos incluyen imágenes fluorescentes, inmunohistoquímica, western blot o análisis histoquímico del producto del gen reportero5,6,7. Sin embargo, debido a la restricción de tamaño de los AAV, no siempre es factible incluir genes reporteros para monitorear la eficiencia de la transducción. El uso de promotores fuertes como el potenciador híbrido cmV / beta-actina de pollo o el elemento regulador post-transcripcional de la hepatitis de Woodchuck (WPRE) como una secuencia estabilizadora de ARNm complica aún más el problema de tamaño8. Por lo tanto, también será beneficioso definir la tasa de transducción de los AV inyectados con una metodología más directa.
La PCR digital de gotas (dd-PCR) es una técnica poderosa para cuantificar el ADN objetivo a partir de cantidades diminutas de muestras. La tecnología dd-PCR depende de la encapsulación de la mezcla de reacción de ADN y PCR objetivo mediante gotas de aceite. Cada reacción dd-PCR contiene miles de gotas. Cada gota se procesa y analiza como una reacción PCR independiente9. El análisis de gotas permite calcular el número de copia absoluta de moléculas de ADN objetivo en cualquier muestra simplemente utilizando el algoritmo de Poisson. Dado que la eficiencia de transducción de los AAV se correlaciona con el número de copias de los genomas de AAV en la retina neuronal, utilizamos el método dd-PCR para cuantificar los genomas de AAV.
Aquí, describimos una metodología de dd-PCR para calcular la eficiencia de transducción de vectores AAV a partir de ADN genómico retiniano6,10. En primer lugar, los AAV que expresan tdTomato reporter se generaron utilizando el protocolo a pequeña escala, y se titularon mediante el método dd-PCR11. En segundo lugar, los AV se inyectaron intravítreamente en la retina neuronal. Para demostrar la eficiencia de la transducción, primero cuantificamos la expresión de tdTomato utilizando microscopía fluorescente y software ImageJ. Esto fue seguido por el aislamiento del ADN genómico para la cuantificación de genomas AAV en retinas inyectadas mediante dd-PCR. La comparación de los niveles de expresión de tdTomato con los genomas de AAV transducidos cuantificados por la dd-PCR mostró que el método de dd-PCR cuantificó con precisión la eficiencia de transducción de los vectores AAV. Nuestros protocolos demostraron una descripción detallada de una metodología basada en dd-PCR para cuantificar las eficiencias de transducción AAV. En este protocolo, también mostramos el número absoluto de genomas AAV que se transducen después de las inyecciones intravítreas simplemente utilizando el factor de dilución después del aislamiento genómico del ADN y los resultados de dd-PCR. En general, este protocolo proporciona un método poderoso, que sería una alternativa a la expresión reportera para cuantificar las eficiencias de transducción de los vectores AAV en la retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, generamos dos vectores AAV que tienen diferentes proteínas de cápside y luego los titulamos en consecuencia. Uno de los pasos más cruciales de este protocolo es producir cantidades suficientes de AAV que produzcan una expresión detectable del reportero después de la transducción12,13.
La titulación de los AAV también es un factor importante para ajustar las dosis de AAV para las inyecciones intravítreas. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner y prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmología Molecular y Clínica de Basilea, Complex Viruses Platform por su ayuda y apoyo para la producción de AAV. También nos gustaría agradecer al Prof. Jean Bennett, de la Escuela de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania por la cepa AAV8 /BP2. El trabajo con animales se realiza en las instalaciones de animales de la Universidad Técnica de Gebze. Por eso, agradecemos a Leyla Dikmetas y al Prof. Uygar Halis Tazebay por la asistencia técnica y el apoyo para la cría de animales. Fatma Ozdemir por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de TUBITAK, números de subvención 118C226 y 121N275, y la beca de integración de la Universidad de Sabanci.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
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