マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法
Summary
このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。
Abstract
多くのレチナル細胞生物学研究所は現在、遺伝子編集や規制アプリケーションのためにアデノ関連ウイルス(AAV)を日常的に使用しています。AAVの伝達の効率は、通常、全体的な実験結果に影響を与える重要です。トランスダクション効率の主な決定要因の1つは、AAVベクターの血清型または変異体です。 現在、様々な人工AAV血清型および変異体は、細胞表面受容体をホストするために異なる親和性を有して利用可能である。遺伝子の遺伝子治療では、異なるレチナル細胞タイプに対して様々な程度の伝達効率が得られます。また、AAV産生の噴射経路および品質も、AAVの変換効率に影響を与える可能性があります。したがって、さまざまなバリアント、バッチ、および方法論の効率を比較することが不可欠です。デジタル液滴PCR(dd-PCR)法は、核酸を高精度に定量化し、標準や基準を使用せずに特定のターゲットの絶対定量を行うことができます。dd-PCRを用いて、注入されたレチナ内のAAVゲノムコピー数を絶対定量化することにより、AAVのトランスダクション効率を評価することも可能です。ここでは、dd-PCRを用いて、レチナル細胞内のAAVのトランスダクション率を定量化する簡単な方法を提供します。マイナーな改変により、この方法論は、ミトコンドリアDNAのコピー数定量化の基礎となり、いくつかの疾患および遺伝子治療用途に不可欠なベース編集の効率を評価する基礎となる可能性もあります。
Introduction
アデノ関連ウイルス(AAV)は現在、様々な遺伝子治療研究に一般的に使用されています。AAVは、より少ない免疫原性と少ないゲノム統合で、安全で効率的な遺伝子導入方法を提供します。標的細胞へのAAVの侵入はエンドサイトーシスを介して起こり、細胞表面1,2上の受容体および共受容体の結合を必要とする。したがって、異なる細胞タイプに対するAAVのトランスダクション効率は、主にキャプシドおよびその宿主細胞受容体との相互作用に依存する。AAVには血清型があり、各血清型は、明確な細胞/組織の栄養と伝達効率を持つことができます。また、ウイルスキャプシドの化学修飾によって生成される人工AAV血清型および変異体、ハイブリッドキャプシドの産生、ペプチド挿入、キャプシドシャッフル、指向進化、および合理的突然変異誘発3もある。アミノ酸配列やカプシド構造のわずかな変化でさえ、宿主細胞因子との相互作用に影響を及ぼし、異なる栄養価を有する。カプシド変異体に加えて、AAV産生の注入経路およびバッチ間変動のような他の要因は、神経性レチナにおけるAAVの導入効率に影響を与える可能性がある。したがって、異なるバリアントのトランスダクション率の比較のための信頼性の高い方法が必要です。
AAVの導入効率を決定する方法の大部分は、レポーター遺伝子発現に依存する。これらには、蛍光イメージング、免疫染色化学、ウェスタンブロット、またはレポーター遺伝子産物5、6、7の構造化学的分析が含まれる。しかし、AAVのサイズ制約により、伝達効率を監視するレポーター遺伝子を含めることが必ずしも可能であるとは限りません。ハイブリッドCMVエンハンサー/チキンβ-アクチンまたはウッドチャック肝炎転写後調節要素(WPRE)のような強力なプロモーターをmRNA安定剤配列として用い、サイズ問題8をさらに複雑にする。したがって、より直接的な方法論で注入されたAAVのトランスダクション率を定義することも有益です。
デジタル液滴PCR(dd-PCR)は、微量のサンプルからターゲットDNAを定量化する強力な手法です。dd-PCR技術は、油滴による標的DNAおよびPCR反応混合物の封入に依存する。各dd-PCR反応には、数千個の液滴が含まれています。各液滴は、独立したPCR反応9として処理され、分析される。液滴の解析により、ポアソンアルゴリズムを使用するだけで、任意のサンプル中の標的DNA分子の絶対コピー数を計算できます。AAVのトランスダクション効率は神経筋のAAVゲノムのコピー数と相関しているため、Dd-PCR法を用いてAAVゲノムを定量化しました。
ここでは、遺伝子組換えDNA6,10からAAVベクターの導入効率を算出するdd-PCR方法論について説明する。まず、tdTomatoレポーターを発現するAAVを小規模プロトコルを用いて生成し、dd-PCR法11で煮込んだ。第二に、AAVは本当に神経細胞のretinaに注入された。トランスダクション効率を実証するために、まず蛍光顕微鏡とImageJソフトウェアを用いてtdTomato発現を定量化しました。その後、dd-PCRを用いて注入されたレティナにおけるAAVゲノムの定量化のためのゲノムDNAの単離が行われた。tdTomato発現量とdd-PCRによって定量されたトランスタイズされたAAVゲノムとの比較は、dd-PCR法がAAVベクターのトランスダクション効率を正確に定量することを示した。当社のプロトコルは、AAVの変換効率を定量化するためのdd-PCRベースの方法論の詳細な説明を示しました。本プロトコルでは、ゲノムDNA単離後の希釈因子とdd-PCR結果を用いて、細胞内注射後にトランスデュージされるAAVゲノムの絶対数も示す。全体として、このプロトコルは、レチナにおけるAAVベクターの伝達効率を定量化するレポーター式に代わる強力な方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、異なるキャプシドタンパク質を有する2つのAAVベクターを生成し、それに応じてそれらをtiteredした。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、トランスダクション12,13の後に検出可能なレポーター式をもたらす十分な量のAAVを生成することです。
AAV の titering も、AAV の投与量を調整する重要な要因で?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Oezkan Keles、ジョセフィーヌ・ユットナー、ボトンド・ロスカ教授(分子・臨床眼科バーゼル研究所)のAAV生産に対する支援と支援に感謝します。また、AAV8/BP2株に関しては、ペンシルベニア大学ペレルマン医学部のジーン・ベネット教授にも感謝したいと思います。ゲブゼ工科大学の動物施設で動物の作業を行います。そのために、レイラ・ディクメタスとウイガー・ハリス・タゼベイ教授に、動物の畜産に対する技術支援と支援に感謝します。また、ファトマ・オズデミール博士の原稿に対するコメントに感謝したいと思います。この作業は、TUBITAK、補助金番号118C226と121N275、およびサバンチ大学統合助成金によってサポートされています。
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
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