数字液滴PCR法定量分析小鼠视网膜AAV转导效率
Summary
该协议介绍了如何使用数字液滴PCR（dd-PCR）以及小规模AAV生产，玻璃体内注射，视网膜成像和视网膜基因组DNA分离来量化小鼠视网膜中的AAV转导效率。
Abstract
许多视网膜细胞生物学实验室现在经常使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导的效率通常是至关重要的，这会影响整体实验结果。转导效率的主要决定因素之一是AAV载体的血清型或变体。 目前，各种人工AAV血清型和变体可用于宿主细胞表面受体的不同亲和力。对于视网膜基因治疗，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率不同。此外，注射路线和AAV生产的质量也可能影响视网膜AAV转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的效率至关重要。数字液滴PCR（dd-PCR）方法以高精度定量核酸，并允许在没有任何标准品或参考的情况下对给定靶标进行绝对定量。使用dd-PCR，通过绝对定量注射视网膜内的AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率也是可行的。在这里，我们提供了一种使用dd-PCR量化视网膜细胞中AAV转导率的简单方法。通过微小的修改，这种方法也可以成为线粒体DNA拷贝数定量的基础，以及评估碱基编辑的效率，这对于几种视网膜疾病和基因治疗应用至关重要。
Introduction
腺相关病毒（AAV）现在通常用于各种视网膜基因治疗研究。AAV提供了一种安全有效的基因递送方式，免疫原性较低，基因组整合较少。AAV通过内吞作用进入靶细胞，这需要细胞表面受体和共受体结合1，2。因此，AAV对不同细胞类型的转导效率主要取决于衣壳及其与宿主细胞受体的相互作用。AAV具有血清型，每种血清型可以具有不同的细胞/组织向性和转导效率。还有人工AAV血清型和变异，通过化学修饰病毒衣壳，杂交衣壳的产生，肽插入，衣壳洗牌，定向进化和合理诱变产生3。即使氨基酸序列或衣壳结构的微小变化也会对与宿主细胞因子的相互作用产生影响，并导致不同的趋向性4。除了衣壳变异体外，其他因素，如注射途径和AAV生产的批次间变异，都会影响AAV在神经元视网膜中的转导效率。因此，需要可靠的方法来比较不同变体的转导速率。
大多数测定AAV转导效率的方法依赖于报告基因表达。这些包括荧光成像，免疫组织化学，蛋白质印迹或报告基因产物5，6，7的组织化学分析。然而，由于AAV的大小限制，包括报告基因来监测转导效率并不总是可行的。使用强启动子，如杂交CMV增强子/鸡β-肌动蛋白或Woodchuck肝炎转录后调节元件（WPRE）作为mRNA稳定剂序列，进一步使大小问题8复杂化。因此，使用更直接的方法定义注入的AAV的转导率也是有益的。
数字液滴PCR（dd-PCR）是一种从微量样品中定量靶DNA的强大技术。dd-PCR技术依赖于通过油滴封装靶DNA和PCR反应混合物。每个dd-PCR反应都含有数千个液滴。每个液滴作为独立的PCR反应进行处理和分析9。液滴分析只需使用泊松算法即可计算出任何样品中靶DNA分子的绝对拷贝数。由于AAV的转导效率与神经元视网膜中AAV基因组的拷贝数相关，因此我们使用dd-PCR方法量化AAV基因组。
在这里，我们描述了一种dd-PCR方法，用于计算来自视网膜基因组DNA6，10的AAV载体的转导效率。首先，使用小规模方案生成表达tdTomato报告的AAV，并通过dd-PCR方法11滴定。其次，AAV被玻璃体内注射到神经元视网膜中。为了证明转导效率，我们首先使用荧光显微镜和ImageJ软件量化了tdTomato表达。随后使用dd-PCR分离基因组DNA，用于定量注射视网膜中的AAV基因组。tdTomato表达水平与dd-PCR定量转导的AAV基因组的比较表明，dd-PCR方法准确量化了AAV载体的转导效率。我们的实验方案展示了一种基于dd-PCR的量化AAV转导效率的方法的详细说明。在该协议中，我们还显示了玻璃体内注射后转导的AAV基因组的绝对数量，只需使用基因组DNA分离和dd-PCR结果后的稀释因子即可。总体而言，该协议提供了一种强大的方法，该方法将成为报告表达的替代方法，以量化视网膜中AAV载体的转导效率。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中，我们生成了两个具有不同衣壳蛋白的AAV载体，然后相应地滴定它们。该协议最关键的步骤之一是产生足够量的AAV，这将在转导12，13之后产生可检测的报告者表达。
AAV的滴度也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦达到这些重要标准，就可以通过dd-PCR方法量化AAV的转导效率。
许多实验室正在…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Oezkan Keles，Josephine Jüttner和巴塞尔分子与临床眼科研究所的Botond Roska教授，复杂病毒平台对AAV生产的帮助和支持。我们还要感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授的AAV8 / BP2菌株。动物工作在盖布泽技术大学动物设施进行。为此，我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授对畜牧业的技术援助和支持。我们还要感谢Fatma Ozdemir博士对手稿的评论。这项工作得到了TUBITAK，授权号118C226和121N275以及Sabanci University Integration grant的支持。
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
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