Dit protocol presenteert hoe AAV-transductie-efficiëntie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van digitale druppel PCR (dd-PCR) samen met kleinschalige AAV-productie, intravitreale injectie, retinale beeldvorming en retinale genomische DNA-isolatie.
Veel retinale celbiologische laboratoria gebruiken nu routinematig Adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) voor genbewerking en regulerende toepassingen. De efficiëntie van AAV-transductie is meestal van cruciaal belang, wat de algehele experimentele resultaten beïnvloedt. Een van de belangrijkste determinanten voor transductie-efficiëntie is het serotype of de variant van de AAV-vector. Momenteel zijn verschillende kunstmatige AAV-serotypen en varianten beschikbaar met verschillende affiniteiten om celoppervlakreceptoren te hosten. Voor retinale gentherapie resulteert dit in verschillende gradaties van transductie-efficiëntie voor verschillende retinale celtypen. Bovendien kunnen de injectieroute en de kwaliteit van de AAV-productie ook van invloed zijn op de retinale AAV-transductie-efficiëntie. Daarom is het essentieel om de efficiëntie van verschillende varianten, batches en methodologieën te vergelijken. De digitale druppel PCR (dd-PCR) methode kwantificeert de nucleïnezuren met hoge precisie en maakt het mogelijk om absolute kwantificering van een bepaald doel uit te voeren zonder enige standaard of referentie. Met behulp van dd-PCR is het ook mogelijk om de transductie-efficiëntie van AAV’s te beoordelen door absolute kwantificering van AAV-genoomkopieën in een geïnjecteerd netvlies. Hier bieden we een eenvoudige methode om de transductiesnelheid van AAV’s in retinale cellen te kwantificeren met behulp van dd-PCR. Met kleine aanpassingen kan deze methodologie ook de basis vormen voor de kwantificering van het aantal kopieën van mitochondriaal DNA en het beoordelen van de efficiëntie van base editing, cruciaal voor verschillende retinale ziekten en gentherapietoepassingen.
Adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) worden nu vaak gebruikt voor een verscheidenheid aan retinale gentherapiestudies. AAV’s bieden een veilige en efficiënte manier van genafgifte met minder immunogeniciteit en minder genoomintegraties. AAV-toegang tot de doelcel vindt plaats door endocytose, die binding van receptoren en co-receptoren op het celoppervlak vereist1,2. Daarom hangt de transductie-efficiëntie van AAV’s voor verschillende celtypen voornamelijk af van de capsid en zijn interacties met de gastheercelreceptoren. AAV’s hebben serotypen en elk serotype kan verschillende cellulaire / weefseltropismen en transductie-efficiëntie hebben. Er zijn ook kunstmatige AAV-serotypen en varianten gegenereerd door chemische modificatie van de viruscapside, productie van hybride capsiden, peptide-insertie, capsid schuifelen, gerichte evolutie en rationele mutagenese3. Zelfs kleine veranderingen in aminozuurvolgorde of capsidstructuur kunnen een invloed hebben op interacties met gastheercelfactoren en resulteren in verschillende tropismen4. Naast capsid-varianten kunnen andere factoren zoals injectieroute en batch-to-batchvariatie van AAV-productie de transductie-efficiëntie van AAV’s in het neuronale netvlies beïnvloeden. Daarom zijn betrouwbare methoden voor de vergelijking van transductiesnelheden voor verschillende varianten noodzakelijk.
De meeste methoden voor het bepalen van de AAV-transductie-efficiëntie zijn afhankelijk van reporter-genexpressie. Deze omvatten fluorescerende beeldvorming, immunohistochemie, western blot of histochemische analyse van het reporter-genproduct5,6,7. Vanwege de groottebeperking van AAV’s is het echter niet altijd haalbaar om reportergenen op te nemen om de transductie-efficiëntie te bewaken. Het gebruik van sterke promotors zoals de hybride CMV-versterker / kip beta-actine of Woodchuck hepatitis post-transcriptioneel regulerend element (WPRE) als een mRNA-stabilisatorsequentie compliceert het grootteprobleemverder 8. Daarom zal het ook nuttig zijn om de transductiesnelheid van geïnjecteerde AAV’s te definiëren met een meer directe methodologie.
Digitale druppel PCR (dd-PCR) is een krachtige techniek om doel-DNA te kwantificeren uit minuscule hoeveelheden monsters. dd-PCR-technologie is afhankelijk van de inkapseling van het doel-DNA en het PCR-reactiemengsel door oliedruppeltjes. Elke dd-PCR-reactie bevat duizenden druppeltjes. Elke druppel wordt verwerkt en geanalyseerd als een onafhankelijke PCR-reactie9. Analyse van druppels maakt het mogelijk om het absolute aantal doel-DNA-moleculen in elk monster te berekenen door simpelweg het Poisson-algoritme te gebruiken. Omdat de transductie-efficiëntie van de AAV’s gecorreleerd is met het kopieaantal AAV-genomen in het neuronale netvlies, gebruikten we de dd-PCR-methode om AAV-genomen te kwantificeren.
Hier beschrijven we een dd-PCR-methodologie om de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren te berekenen uit retinaal genomisch DNA6,10. Ten eerste werden AAV’s die tdTomato reporter uitdrukken gegenereerd met behulp van het kleinschalige protocol en getiterd door de dd-PCR-methode11. Ten tweede werden AAV’s intravitreally geïnjecteerd in het neuronale netvlies. Om de transductie-efficiëntie aan te tonen, hebben we eerst tdTomato-expressie gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie en ImageJ-software. Dit werd gevolgd door de isolatie van genomisch DNA voor de kwantificering van AAV-genomen in geïnjecteerde netvliezen met behulp van dd-PCR. Vergelijking van tdTomato-expressieniveaus met de getransduceerde AAV-genomen gekwantificeerd door de dd-PCR toonde aan dat de dd-PCR-methode de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren nauwkeurig kwantificeerde. Onze protocollen toonden een gedetailleerde beschrijving van een op dd-PCR gebaseerde methodologie om de efficiëntie van AAV-transductie te kwantificeren. In dit protocol tonen we ook het absolute aantal AAV-genomen dat wordt getransduceerd na intravitreale injecties door simpelweg de verdunningsfactor te gebruiken na genomische DNA-isolatie en de dd-PCR-resultaten. Over het algemeen biedt dit protocol een krachtige methode, die een alternatief zou zijn voor reporterexpressie om transductie-efficiëntie van AAV-vectoren in het netvlies te kwantificeren.
In dit protocol hebben we twee AAV-vectoren gegenereerd die verschillende capsid-eiwitten hebben en ze vervolgens dienovereenkomstig getiterd. Een van de meest cruciale stappen van dit protocol is het produceren van voldoende hoeveelheden AAV’s die detecteerbare reporterexpressie opleveren na de transductie12,13.
Titering van AAV’s is ook een belangrijke factor om de doseringen van AAV voor intravitreale injecties aan te passen. Zodra …
The authors have nothing to disclose.
We willen Oezkan Keles, Josephine Jüttner en Prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform bedanken voor hun hulp en ondersteuning voor de productie van AAV. We willen ook Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, de Universiteit van Pennsylvania bedanken voor de AAV8 / BP2-stam. Dierwerk wordt uitgevoerd in de dierenfaciliteit van de Gebze Technical University. Daarvoor bedanken we Leyla Dikmetas en Prof. Uygar Halis Tazebay voor technische assistentie en ondersteuning voor de veehouderij. We willen ook Dr. Fatma Ozdemir bedanken voor haar commentaar op het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door TUBITAK, subsidienummers 118C226 en 121N275, en Sabanci University Integration grant.
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
Isoflurane | ADEKA LAÇ SANAY VE TCARET A.. | N01AB06 | anesthetic |
Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. | S01FA06 | pupil dilation |
Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |